Polimorfismo dei frammenti di restrizione

[dario fgx]

ki sa spiegarmi come l'rflp consente di individuare un dato gene, e come funziona esattamente tutto il pasticcio? attenzione dovete spiegarlo più chiaramente del mio libro di biologia è l'unica cosa che nn ho mai capito di tutta la biologia riversatami in testa

[Lorekon]

parto dal presupposto che tu sappia cos'è un allele, un locus genico e un genem e un enzima.

premessa: gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che "tagliano" ("restringono") il DNA in modo sequenza-specifico, ce ne sono moltissimi diversi, ognuno ha un nome diverso e la sua sequenza di riconoscimento incui va a tagliare il DNa (p.es il più famoso e usato è EcoRI che taglia GAAATTC e lo fa diventare G / AATTC (tagli atra la A e la G). Ovviamente tagli aanche l'altro filamento della doppia elica che come noterai è complementare: CTTAAG -> C / TTAAG.

questa è la base del "taglia-e-cuci" del DNA (o meglio, è il "taglia", il "cuci" la prossima volta )

allora, veniamno a noi:
ad un determinato locus, possono esistere diversi alleli (a patto di non violare la colinearità, ma lasciamo stare ).

alleli diversi = sequenze di DNA diverse (anche di poco magari).

qualora in un allele ci fosse una sequenza "tagliata" da un certo enzima di restrizione e non ci fosse sull'altro allele, tu tagliando entrambi gli alleli avresti che uno si taglia e l'altro no.

analizzando in un certo modo (se vuoi poi ti spiego) i frammenti ottenuti da queste digestioni diagnostiche fatte sul DNA con l'enzima di restrizione che hai scelto, si possono ottenere dei polimorfismi, ossia delle "differenze di lunghezza" dei frammenti ottenuti.

RFLP:
Restriction
Fragment
Lenght
Polimorphism

se becchi una differenza, vuol dire che in uno dei due c'è o manca il sito per quel particolare enzima, che implica la presenza di due alleli diversi.

sapendo che ad un certo allele è associata una particolare patologia di origine genetica p.es puoi diagnosticare la patologia e/o vedere se è stata ereditata.


tutto questo in breve, sperando che nessun purista venga a fare il "precisino"

[dario fgx]

sembrerò stupudo ma questo concetto mi è sempre risultato un po troppo ostico, ti dico quel che credo di capire io che mi sembra sia errato:
l'enzima (di restr.) taglia una determinata sequenza di basi in modo univoco, sapendo che ad ogni rflp è associato un locus cromosomico (o viceversa?) a quel locus
è associata una particolare patologia di origine genetica p.es puoi diagnosticare la patologia e/o vedere se è stata ereditata.ora nn capisco l'utilità dell'rflp proprio nn mi entra qual'è esattamente la differenza che va ad evidenziare?
grazie

[Lorekon]

mi sa che non mi sono spiegato...

gli alleli hanno ciascuno una propria sequenza di basi di DNA...
se in questa sequenza di basi compare il sito di taglio dell'enzima (p. es GAATTC), l'enzima taglia...
se non compare il sito di taglio, l'enzima non taglia.
l'enzima taglia SOLAMENTE se trova il sito in cui è in grado di tagliare. Se no lo trova, no.

se un allele ha il sito e l'altro no, puoi distinguerli in base al fatto che l'enzima ne taglia uno e non l'altro.


la differenza che va a d evidenziare la RFLP è che esiste una differenza di sequenza di DNA, quindi (ponendo che sia nota la sequenza dell'allele "malato") che sia presente l'allele malato.

cmq questa è solo una delle applicazioni possibili.

[Dr Nick Riviera]

I marcatori genici sono delle sequenze note di riferimento, un esempio di essi sono gli RFLP, la loro esistenza è dovuta al fatto che variazioni ereditarie, o mutazioni, portano a lunghezze differenti dei frammenti prodotti dagli enzimi di restrizione.
Attraverso un elettroforesi fai correre 2 campioni precedentemente trattati con un enzima di restrizione (che come detto da Lorekon tagliano in punti precisi della sequenza di DNA). La sequenza di DNA è costituita da una serie di lettere, l'enzima riconosce una determinata serie di lettere (a seconda dell'enzima) all'interno dell'intera sequenza e taglia in quel punto il DNA.
Se i 2 campioni analizzati sono uguali otterresti dopo una corsa elettroforetica questo:

c1 c2

- -
- -


- -
- -
- -

Se invece i 2 campioni non sono uguali, non si avranno gli stessi tagli con quel determinato enzima, per cui il risultato potrebbe essere:

c1 c2

- -
-
. -
. -
- -
- -

Notare che la seconda banda dell'alto del c2 nel primo caso, non c'è nel secondo dove si deduce che in questo caso ci sia una zona di taglio per l'enzima..
Questi dati vengono poi analizzati a seconda dell'applicazione.

[Lorekon]

si ma almeno spiegagli cos'è una analisi elettroforetica...
sennò non vale!



che lavoro fai?

[Dr Nick Riviera]

Spero lo sappia.. sennò è 'na noia...
Comunque in breve e molto in generale un'elettroforesi è una separazione di frammenti di dna (previa digestione con enzimi di restrizione e marcatura del campione) su un supporto che di solito è agarosio.. Il tutto avviene in una cella (elettroforetica) attraversata da un flusso di corrente continua, il DNA è negativo e pertanto migra verso l'anodo... Le distanze di migrazione elettroforetica di frammenti di DNA su gel di agarosio sono inversamente proporzionati alla loro massa e quindi alla loro lunghezza per cui le molecole più grosse (frammenti più lunghi) rimangono più in alto (più vicino ai pozzetti nei quali si è caricato il campione) mentre le molecole più corte si trovano più in basso. Le lunghezze dei vari frammenti vengono poi stabilite confrontando i frammenti con un marker che è del dna frammentato (fagico.. mi pare) che ha lunghezza nota..
Non so se mi sono spiegato bene...


@Lorekon: Studio Biotecnologie vegetali e microbiche (Laurea Specialistica) all'Università degli Studi di Pisa.

[Lorekon]

allora siamo quasi colleghi

l'analisi elettroforetica per i non addetti ai lavori è: si fa un budinazzo basico (pH 8 di solito) con un particolare polisaccaride strutturale (agarosio) estratto da un'alga del pacifico (specie Sarcazzo sarcazzus ) con dei "forellini", si mette dentro il campione di DNA nei "forellini" o "pozzetti" e si applica un campo elettrico, tra i 2 e gli 8 V/cm di solito, e il DNA si sposta verso il (-) con velocità inversamente proporzionale alla lunghezza della sequenza.

per sapere la lughezza dei frammenti nel campione si mette appunto un "campione marker" che contiene frammenti di lunghezza nota (di solito DNA di fago lambda digerito appositamente, ma per chi lavora in un lab con la grana ci sono i marker commerciali)

per marcare il DNA si mette una sostanza, l'etidio bromuro (nome IUPAC complicato, che non so mai) che si intercala tra i due filamenti della doppia elica e migra insieme. Poi si illumina con gli UV e l'etidio fluoresce, e si può fotografare (io lo metto nel "budinazzo", ma c'è chi lo mette nel campione).
il gel si può anche colorare dopo la corsa elettroforetica, anzi sarebbe meglio, ma per praticità non si fa.


ciauz e buono studio

[Lorekon]

Nick Riviera hai pvt

[Dr Nick Riviera]

Originariamente inviato da Lorekon

Nick Riviera hai pvt