Benzodiazepine e strane rilevazioni strumentali

[F1R3BL4D3]

Ho una questione da risolvere in laboratorio. è lunghetta ma tant'è...

C'è un campione X contenente un dosaggio elevato di Lorazepam (una benzodiazepina).
Questo campione a concentrazione intera (1:1) fa segnare valori fra i 77 ng/mL e gli 85 ng/mL e quindi risulta negativo con reazione antigene-anticorpo.
Gli standard utilizzati per la calibrazione sono proprio di Lorazepam e quindi ci dovrebbe essere piena corrispondenza (oltre che controlli con valori corretti).
A questo punto lo si diluisce 1:2 con soluzione fisiologica e si ottiene 47 ng/mL.

Se però lo si idrolizza seguendo la metodica (con β glucoronidasi) senza diluizione esce dalla curva (e quindi segna come superiore al limite).
Se lo si diluisce 1:2 stessa situazione che si ripete anche a 1:4.
Con diluizione di 1:10 segna un valore di circa 600 ng/mL.

Escludendo l'effetto hook sull'intero (non tornerebbe il valore ottenuto con la diluizione 1:2) cosa potrebbe essere il problema?

al momento non mi viene in mente niente, magari a qualcuno invece si...

[Lorekon]

- qualcosa (che c'è nel campione e non negli standard) inibisce il saggio con l'anticorpo.
(ma esistono anticorpi contro i farmaci? )
(ma si possono fare misure quantitative con sti anticorpi??)
(ma c'è una curva di taratura?)
(non sarà un ELISA vero? occhio che non è per niente affidabile...)
(la sensibilità del metodo è sufficiente o sei sotto il range lineare? vedo che dà reazione negativa nel saggio con l'anticorpo....)

- idrolizzado e leggedo l'idrolizzato magari si legge qualcosa di altra origine (sempre nel campione e non nello standard) e non un catabolita prodotto con la blucuronidasi. Non so, un catabolita prodotto dal paziente presente nel sangue e assente negli standard.


ma fare una massa proprio non si può?

sei sicurissimo di non aver sbagliato i calcoli, si?

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da Lorekon

- qualcosa (che c'è nel campione e non negli standard) inibisce il saggio con l'anticorpo.

mmm potrebbe essere e magari con la procedura di idrolisi questa sostanza diventa inefficace (alla fine vengono trattate con un enzima e poste per 3 ore a bagnomaria a 65°C).

(ma esistono anticorpi contro i farmaci? )

Sono ab di sintesi. Reagiscono con quasi tutte le benzodiazepine (va beh in questo caso, poi ce ne sono altri per altre sostanze).

la reazione è la seguente:

ab+BENZ+BENZ-G6PDH-> ab-BENZ (inibito)+AB-BENZ-G6PDH (inibito)+BENZ-G6PDH (attivo)

Glucose-6-Fosfato+ NAD+ --->(BENZ-G6PDH)--->6-fosfogluconolactone+ NADH+ H+ (assorbe a 340nm)

ab: anticorpo
BENZ: benzodiazepine
BENZ-G6PDH: coniugato diazepam-glucosio-6-fosfato deidrogenasi

(ma si possono fare misure quantitative con sti anticorpi??)

è qualitativa e semi-quantitativa. E' uno strumento per lo screening. Poi nel caso, si procede a GC-MS. I reattivi sono contenuti in flex già pronti (cartucce) e sono anche da più test (gli stessi su cui sono stati effettuati controlli). Il lotto è il medesimo,etc.etc.

(ma c'è una curva di taratura?)

certo. Anche perchè lo strumento è lo stesso per la routine! i controlli erano buoni e non ci sono state situazioni particolari.

La curva va da 0 ng/mL a 1000 ng/mL. Il cut-off è 200 ng/mL.

(non sarà un ELISA vero? occhio che non è per niente affidabile...)

Na na. Niente ELISA.

(la sensibilità del metodo è sufficiente o sei sotto il range lineare? vedo che dà reazione negativa nel saggio con l'anticorpo....)

I campioni idrolizzati con diluizione fino a 1:4 erano superiori e quindi lo strumento dice solo che sono superiori all'intervallo di misura. Con 1:10 invece siamo riusciti a stare dentro (il 600 ng/mL). Non siamo sotto ma al massimo sopra (ma va beh, problema relativo).

ni, non è che dia reazione negativa. Da un numero che è comunque compatibile e non da 0 ng/mL ma è molto basso (interpretato come negativo).

- idrolizzado e leggedo l'idrolizzato magari si legge qualcosa di altra origine (sempre nel campione e non nello standard) e non un catabolita prodotto con la blucuronidasi. Non so, un catabolita prodotto dal paziente presente nel sangue e assente negli standard.

sono urine (effettivamente non l'ho specificato). Potrebbe essere, ma al momento non ci è venuto in mente niente che potesse interferire in questo modo.

ma fare una massa proprio non si può?

eh, insomma...è un periodo dove purtroppo la massa lavora a pieno ritmo. Poi comunque c'è chiarire stà situazione.

sei sicurissimo di non aver sbagliato i calcoli, si?

va beh, diluizioni 1:2, 1:4 e 1:10 le so fare.

Ah, un controllo messo ad idrolizzare insieme al campione X e diluito è venuto in maniera corretta. Quindi tralasciando altre cause, l'enzima d'idrolisi non ha causato problemi. Ovviamente tralasciando un ipotetica sostanza presente nel campione e non nel controllo.

[F1R3BL4D3]

Up!

[Lorekon]

risolto?

per escludere l'inibizione potresti mischiare il campione che dà lettura bassa con un altro campione "verificato", tipo 50:50.

se non legge la metà della concentrazione del campione verificato c'è l'inibizione.

[Siddhartha]

Originariamente inviato da Lorekon

(non sarà un ELISA vero? occhio che non è per niente affidabile...)

sulle tecniche di laboratorio sono abbastanza ignorante però ho sempre letto dell'elisa come di un test all'avanguardia (ci fanno anche i controlli di verifica per il test HIV)....come mai dici che non è affidabile? non è una domanda retorica....davvero sono curioso ed ignorante in materia!

@fire: non ho neanche capito quale sia il tuo problema ma posso dirti....ma vattene a mare!!!

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da Lorekon

risolto?

per escludere l'inibizione potresti mischiare il campione che dà lettura bassa con un altro campione "verificato", tipo 50:50.

se non legge la metà della concentrazione del campione verificato c'è l'inibizione.

Allora, oggi ho controllato con la dottoressa le risposte nei due lotti (è cambiato l'anticorpo ultimamente) e sono un vero macello. purtroppo le benzo sono talmente tante che fare un anticorpo che cross-reagisca con tutte in maniera decente è impossibile.

adesso proviamo a vedere due campioni che sono sotto terapia con un farmaco che dovrebbe avere la stessa benzodiazepina. Uno è venuto positivo e l'altro era lì sul cut-off (dubbio). Vedremo cosa ne risulterà dopo l'idrolisi come l'altra volta. La cosa che complica il tutto è che non abbiamo dati precisi sul campione di partenza. Nel senso che ci mancano i dosaggi perchè noi facciamo analisi per i Ser.T ma non siamo proprio in diretto contatto con loro e quindi la dottoressa che segue il paziente è stata vaga e non abbiamo possibilità di fare conti con la farmacodinamica e la farmacocinetica.

insomma è un casino! e stò anche seguendo altri 3 progetti (fra cui la mia tesi, oltre al lavoro di routine).

Originariamente inviato da Siddhartha

sulle tecniche di laboratorio sono abbastanza ignorante però ho sempre letto dell'elisa come di un test all'avanguardia (ci fanno anche i controlli di verifica per il test HIV)....come mai dici che non è affidabile? non è una domanda retorica....davvero sono curioso ed ignorante in materia!

Come tutte le cose ha i suoi pro e contro anche l'ELISA. Comunque son sicurissimo che non sia ELISA perchè non ci sarebbe questa possibilità non essendoci gli anticorpi fissati (cuvette "usa-e-getta" su film plastico).

@fire: non ho neanche capito quale sia il tuo problema ma posso dirti....ma vattene a mare!!!

vado in Svezia per una settimana dal 10. però il tirocinio lo devo fare, se no la tesi me la sogno!

poi è bello avere ogni tanto qualche cosa interessante che non si riesce a spiegare facilmente.

[^TiGeRShArK^]

Pure io ho dei problemi di rilevamento..
mi sballa tutti gli strumenti
http://www.hwupgrade.it/forum/showpo...ostcount=32633

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da ^TiGeRShArK^

Pure io ho dei problemi di rilevamento..
mi sballa tutti gli strumenti
http://www.hwupgrade.it/forum/showpo...ostcount=32633

spammone.

[Lorekon]

Originariamente inviato da F1R3BL4D3

Allora, oggi ho controllato con la dottoressa le risposte nei due lotti (è cambiato l'anticorpo ultimamente) e sono un vero macello. purtroppo le benzo sono talmente tante che fare un anticorpo che cross-reagisca con tutte in maniera decente è impossibile.

adesso proviamo a vedere due campioni che sono sotto terapia con un farmaco che dovrebbe avere la stessa benzodiazepina. Uno è venuto positivo e l'altro era lì sul cut-off (dubbio). Vedremo cosa ne risulterà dopo l'idrolisi come l'altra volta. La cosa che complica il tutto è che non abbiamo dati precisi sul campione di partenza. Nel senso che ci mancano i dosaggi perchè noi facciamo analisi per i Ser.T ma non siamo proprio in diretto contatto con loro e quindi la dottoressa che segue il paziente è stata vaga e non abbiamo possibilità di fare conti con la farmacodinamica e la farmacocinetica.

insomma è un casino! e stò anche seguendo altri 3 progetti (fra cui la mia tesi, oltre al lavoro di routine).

ah, pensavo che essendo cose di diagnostica fossero ultra-certificate e validate.
non immaginavo che gli ab fossero aspecifici (era la cosa più ovvia ma l'ho scartata perchè mi pareva improbabile)
ma non sono monoclonali?
cioè, fate diagnostica con dei policlonali?
la cosa è alquanto strana per non dire inquietante...

è chiaro che dovete fare (o far fare) un dot-blot (o uno slot-blot) con tutte le specie chimiche e vedere quale anticorpo reagisce con quale composto, sennò così e un pò "alla cieca".

ma quasi quasi una cromatografia "home-made" sarebbe la cosa più semplice a questo punto.
Vuoi che non esistano colonnine per le benzodiazepine?

[Lorekon]

Originariamente inviato da Siddhartha

sulle tecniche di laboratorio sono abbastanza ignorante però ho sempre letto dell'elisa come di un test all'avanguardia (ci fanno anche i controlli di verifica per il test HIV)....come mai dici che non è affidabile? non è una domanda retorica....davvero sono curioso ed ignorante in materia!

me l'hanno detto quelli che li usano
di più non so.

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da Lorekon

ah, pensavo che essendo cose di diagnostica fossero ultra-certificate e validate.

ma quello si. O meglio, è proprio che le benzodiazepine sono una classe ampia, molto più di tutte le altre. Per avere uno screaning su tutto hanno dovuto abbassare la specificità per una determinata classe.

non immaginavo che gli ab fossero aspecifici (era la cosa più ovvia ma l'ho scartata perchè mi pareva improbabile)

Sono specifici per le benzodiazepine (c'è scritto quali rilevano). Ma la cross-reazione non è mai del 100% perchè devono essere ad ampio raggio.

ma non sono monoclonali?

Non saprei. Ovviamente le ditte non ti dicono queste cose, già non ti dicono quando cambiano l'anticorpo, fai te...

cioè, fate diagnostica con dei policlonali?
la cosa è alquanto strana per non dire inquietante...

non è diagnostica ma screaning. Perchè poi vengono riconfermate al GC-MS in determinati casi.

è chiaro che dovete fare (o far fare) un dot-blot (o uno slot-blot) con tutte le specie chimiche e vedere quale anticorpo reagisce con quale composto, sennò così e un pò "alla cieca".

Ehhh, questo poi si vedrà. Ma comunque si è rivelato perfetto per tutti gli altri esami. E' proprio questa situazione ad essere strana. Essendo una macchina "chiusa" (niente reattivi di preparare, impossibilità di contaminare a valle,etc.etc) gli errori umani sono ridottissimi se non impossibili.

ma quasi quasi una cromatografia "home-made" sarebbe la cosa più semplice a questo punto.
Vuoi che non esistano colonnine per le benzodiazepine?

C'è la riconferma cromatografica per le benzo. Ma si fa su un determinato tipo di campioni. sai, essendo l'unico laboratorio di tossicologia per la provincia di Varese, la massa è sempre stra-impegnata. Più che altro c'è da chiarire questa cosa, la massa si potrebbe fare, se però non fossimo stracarichi di lavoro per via della commissione patenti che in queste settimane ha riempito l'agenda.


Comunque:

oggi abbiamo visto che diluendo il campione intero e non idrolizzato sia 1/10 che 1/20 i risultati continuano a decrescere. Quindi sarebbe praticamente da scartare un effetto hook a questo punto. Gli altri campioni dei due pazienti sotto terapia, dopo idrolisi, hanno avuto effetto simile a quello del campione X. Sapendo che comunque con l'idrolisi sicuramente deve aumentare la risposta, ma non di così tanto, volevo proporre anche un test in bianco (acqua e B-glucoronidasi) per avere una conferma che non ci sia veramente niente d'altro oltre che una prova facendo solo scaldare il campione senza enzima.

Stà questione è un pò un casino, calibrazione e controlli perfetti (e i controlli sono urine comunque a tutti gli effetti e non soluzioni "preparate"). Cross-reagenza controllata e rispetta le attese. L'unica è, come dicevi tu all'inizio, la possibilità che ci sia una qualche sostanza che impedisca il contatto ag-ab e che venga inattivata a 60°C (per 3 ore) o dall'enzima. Per questo volevo controllare. Il fatto è che la sostanza a questo punto non sarebbe su un campione ma su ben 4.
Domani intanto parlo con la dottoressa e l'aggiorno sui risultati. Poi vedremo come procedere.

[Lorekon]

se scrivi ancora "screAning" propongo il tuo bannaggio dalla sezione

[Lorekon]

Originariamente inviato da F1R3BL4D3

Non saprei. Ovviamente le ditte non ti dicono queste cose, già non ti dicono quando cambiano l'anticorpo, fai te...

ahi ahi ahi signora Longari

dovrebbero dirvelo, batch (il "lotto"), epitopo/i utilizzato/i per l'immunizzazione, dosi e tempi dell'immunizzazione (i richiami influenzano la specificità), animale, metodo e livello di purificazione, sensibilità.

idem se è un monoclonale (altamente auspicabile)

nei prodotti per la ricerca nel bugiardino mettono anche un'immagine di western dell'esperimento che conferma la sensibilità e la specificità.
Se glielo chiedi ti dicono anche cosa aveva mangiato il veterinario
(scherzi a parte, per chi lavora sui vegetali conta anche l'alimentazione dell'animale: mangiando vegetali possono sviluppare anticorpi contro proteine nella dieta e fregarti con le cross-reattività dopo che hai immunizzato).



"a regazzì mica stiamo a pettinà 'e bbambole" (cit.)

[Lorekon]

Originariamente inviato da F1R3BL4D3

C'è la riconferma cromatografica per le benzo. Ma si fa su un determinato tipo di campioni. sai, essendo l'unico laboratorio di tossicologia per la provincia di Varese, la massa è sempre stra-impegnata. Più che altro c'è da chiarire questa cosa, la massa si potrebbe fare, se però non fossimo stracarichi di lavoro per via della commissione patenti che in queste settimane ha riempito l'agenda.

ma anche cromatografia senza massa eh.

una colonnina semplice semplice, fase solida per affinità o a scambio ionico e poi lettura allo spettro in continuo (avrànno un'assorbanza queste benzodiazepine no?).

io raccoglievo le frazioni da 1 ml di eluito una a una, figurati...

IMHO dovreste "farvi sentire" da chi vi ha venduto macchina e kit; non funziona come dovrebbe (IMHO)

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da Lorekon

ahi ahi ahi signora Longari

dovrebbero dirvelo, batch (il "lotto"), epitopo/i utilizzato/i per l'immunizzazione, dosi e tempi dell'immunizzazione (i richiami influenzano la specificità), animale, metodo e livello di purificazione, sensibilità.

la Dade evidentemente non è così. Perchè il lotto ovviamente ce l'abbiamo e sappiamo su cosa si può utilizzare quell'anticorpo. Ma tutto il resto non credo siano propensi a fornircelo. Comunque ho riletto il "bugiardino" e specificano che sono policlonali.

ti manderò via PVT il foglio così controlli, ci sono anche test comparativi GC/MS vs. Flex.

Originariamente inviato da Lorekon

ma anche cromatografia senza massa eh.

C'è solo con la massa per questo te lo dico.

una colonnina semplice semplice, fase solida per affinità o a scambio ionico e poi lettura allo spettro in continuo (avrànno un'assorbanza queste benzodiazepine no?).

Ma quello non è un problema, perchè i controlli sui campioni (dopo lo screening ) vengono fatti su GC/MS.

IMHO dovreste "farvi sentire" da chi vi ha venduto macchina e kit; non funziona come dovrebbe (IMHO)

beh, prima bisogna anche capire bene la situazione, perchè che ci sia qualcosa di anomalo sicuramente. Ma dove precisamente è tutto da capire. Anche perchè i controlli a questo punto (che sono trattati uguali a campioni) vengono in maniera riproducibile. inizio a sentire il responsabile che ne pensa, poi vedremo che si deciderà.

[F1R3BL4D3]

Hai PVT con un'immagine da quasi 1MB.

ah, guarda che c'è anche di che origine è l'anticorpo (per fortuna ce l'ho a casa adesso).

[Lorekon]

"di che origine" è l'anticorpo? non vedo niente... sarà sull'altra facciata del bugiardino?

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da Lorekon

"di che origine" è l'anticorpo? non vedo niente... sarà sull'altra facciata del bugiardino?

C'è scritto (anche perchè il bugiardino finisce lì).

E' scritto verso la metà della prima colonna prima pagina: origine: pecora