Staminali: la riprogrammazione cellulare umana fa un passo avanti

[lowenz]

http://www.molecularlab.it/news/view.asp?n=6583

Riprogrammare cellule adulte umane in modo da farle funzionare come cellule staminali embrionali pluripotenti, è questa la scoperta, pubblicata sull'ultimo numero della rivista "Cell", fatta dal gruppo di ricerca dell'Università di Tokyo diretto da Shinya Yamanaka. Lo studio potrà dare un nuovo slancio alla ricerca sulle staminali.
Gia lo scorso anno Yamanaka aveva annunciato di essere riuscito, grazie all'utilizzo di quattro fattori di trascrizione genetica, a riprogrammare cellule epiteliali di topo ed ora il team di ricerca ha dimostrato che gli stessi fattori di trascrizione (Oct3/4, Sox2, c-Myc, e Klf4) sono in grado di indurre la trasformazione di fibroblasti umani in cellule indistinguibili da cellule embrionali staminali umane.
Gli stessi ricercatori sono rimasti stupiti da questo fatto, dato che si riteneva occorressero più fattori di trascrizione nell'uomo.
Grazie a questo studio sarà forse possibile in futuro utilizzare una fonte alternativa di cellule pluripotenti, evitando così i dilemmi etici legati cui l'utilizzo delle cellule staminali embrionali porta.
Yamanaka ha osservato "Da circa 50.000 cellule umane trattate abbiamo ottenuto approssimativamente una decina di cloni di staminali pluripotenti. Questa potrebbe sembrare un'efficienza molto bassa, ma in realtà significa che da un esperimento con un singolo prelievo di circa dieci centimetri è possibile ottenere svariate linee cellulari di staminali pluripotenti".



In realtà i dilemmi etici sono rimandati fino a quando avremo le totipotenti

[laico79]

Prelievo di 10 cm di che?
Notizia interessante, ottima anche per eventuali cure.

[Lorekon]

l'hanno scorso ho dovuto fare in journal club sull'argomento

le cosiddette "iPS"
http://en.wikipedia.org/wiki/Induced...tent_stem_cell
sono molto promettenti, il problema è che si sono delle questioni tecniche da scavalcare e non è dettoche sia possibile

1) per sovresprimere quei geni-chiave è necessario ributtarli dentro "ingegnerizzati", sotto promotori diversi (che li facciano funzionare anche in quelle cellue, in cui normalmente non sono espressi). quindi le iPS sono TRANSGENICHE.

2) il meccanismo usato per buttar dentro i geni prevede ovviamente una selezione (ergo ANTIBIOTICI) della popolazione cellulare trasformata. 4 geni = 4 diversi antibiotici... comincia a diventare un po rischioso.

3) i vettori per mettere dentro i geni sono - che io sappia - di origine VIRALE, inoltre l'efficienza di trasformazione viene aumentata con delle sequenze di origine virale "pericolosette" (tipo il "SV40 Large T-antigen" e altri) che rendono un pò TROPPO attive le cellule... il ciclo cellulare sballa un pò, pare...
in sostanza, esiste il rischio fondato che queste cellule siano CANCEROGENE.


come dire, tutto è possibile ma prima bisogna vedere di aggiustare il sistema in modo che sia innocuo per il paziente.

Certo, chi ce la fa ha il Nobel in tasca... e non scherzo.

[laico79]

Premetto che non mi intendo cellule staminali cmq ho qualche conoscenza a riguardo di culture cellulari.

Originariamente inviato da Lorekon

1) per sovresprimere quei geni-chiave è necessario ributtarli dentro "ingegnerizzati", sotto promotori diversi (che li facciano funzionare anche in quelle cellue, in cui normalmente non sono espressi). quindi le iPS sono TRANSGENICHE.

Hai mai sentito parlare di overespressione transiente?

Originariamente inviato da Lorekon

2) il meccanismo usato per buttar dentro i geni prevede ovviamente una selezione (ergo ANTIBIOTICI) della popolazione cellulare trasformata. 4 geni = 4 diversi antibiotici... comincia a diventare un po rischioso.

Solitamente sono i batteri ad essere selezionati con gli antibiotici le cellule eucariotiche sono resistenti agli antibiotici (magari soffrono ma lo tutte a soffrire indotte o meno). Devo dire che però non conosco il metodo di selezione.

Originariamente inviato da Lorekon

3) i vettori per mettere dentro i geni sono - che io sappia - di origine VIRALE, inoltre l'efficienza di trasformazione viene aumentata con delle sequenze di origine virale "pericolosette" (tipo il "SV40 Large T-antigen" e altri) che rendono un pò TROPPO attive le cellule... il ciclo cellulare sballa un pò, pare...
in sostanza, esiste il rischio fondato che queste cellule siano CANCEROGENE.


come dire, tutto è possibile ma prima bisogna vedere di aggiustare il sistema in modo che sia innocuo per il paziente.

Certo, chi ce la fa ha il Nobel in tasca... e non scherzo.

Il vettore ha solo un promotore virale ciò significa che non vengono utilizzate proteine virali, per far entra il vettore si usano degli agenti transfettanti (che devo dire sono tossici, non sono mutageni).
Cmq domani mi informo meglio riguardo al metodo di selezione.

[Lorekon]

Originariamente inviato da laico79

Premetto che non mi intendo cellule staminali cmq ho qualche conoscenza a riguardo di culture cellulari.

ah ecco
scommetto che studi medicina

Originariamente inviato da laico79

Hai mai sentito parlare di overespressione transiente?

direi di si
ma non c'entra una ceppa
già la parola OVERESPRESSIONE dovrebbe suggerirti che il promotore (inducibile o no, transiente o no) è diverso da quello normale.
E' altamente improbabile che l'overespressione sia indotta in altro modo (con sostanze, inibendo il repressore et similia).
Negli articoli che avevo dovuto leggere erano tutti 4 geni chimerici buttati dentro. In uno dei primi lavori sull'argomento c'è scritto come fanno
Yamanaka S.
Induction of pluripotent stem cells from mouse fibroblasts by four transcription factors. Cell Prolif. 2008 Feb;41 Suppl 1:51-6.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18181945?ordinalpos=&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.SmartSearch&log$=citationsensor
http://www3.interscience.wiley.com/c...10896/PDFSTART

"The candidate genes were introduced into Fbx15 βgeo/βgeo mouse embryonic fibroblasts (MEF) by retrovirus-mediated transfection and these cells were cultured in ESC medium containing G418. No G418-resitant colonies were obtained with any single factor. However, by combining
four factors (Oct3/4, Sox2, c-Myc and Klf4), multiple G418-resitant colonies were obtained"

traduzione: sono cellule TRANSGENICHE.
NB: La selezione (fibroblasti di topo) era fatta con G418
http://en.wikipedia.org/wiki/Geneticin

Solitamente sono i batteri ad essere selezionati con gli antibiotici le cellule eucariotiche sono resistenti agli antibiotici (magari soffrono ma lo tutte a soffrire indotte o meno). Devo dire che però non conosco il metodo di selezione.

un articolo simile al quello sopra (il primo che mi è capitato sul pubmed in verità) spiega i metodi usati (è solo un esempio ma garantisco che la metodologia è quella)
http://www.nature.com/ncb/journal/v1...df/ncb1827.pdf

"Briefly, 1.5 μg of plasmid was transfected into ES cells in 6-well dishes for RNA and protein
extraction. The sequence of the targeted Esrrb region by RNAi is as follows:
GATTCGATGTACATTGAGA. (...) Puromycin (Sigma) selection was introduced 1 day after transfection at 0.8 μg ml–1, and maintained for 2 to 6 days before collecting."

Originariamente inviato da laico79

Il vettore ha solo un promotore virale ciò significa che non vengono utilizzate proteine virali, per far entra il vettore si usano degli agenti transfettanti (che devo dire sono tossici, non sono mutageni).
Cmq domani mi informo meglio riguardo al metodo di selezione.

NOOOOOOOO
una cosa è TRASFEZIONE (transiente, nelle cellule di mammifero si fa, come dici tu, con Lipofectamina come additivo per aumentare l'efficienza di trasfezione) una cosa la TRASFORMAZIONE (che è STABILE, quelle cellule diventano stabilmente transgeniche, anche se a volte l'espressione del transgene non viene indotta o viene repressa, quando non serve o è dannosa)
ripeto, l'uso di vettori virali TALORA contenenti geni cancerogeni comporta un rischio.

qui
http://www.nature.com/mt/journal/vao...mt200972a.html
(attenzione: non l'ho letto!)
spiegano i più recenti avanzamenti riguardanti l'eliminazione degli inconvenienti che ho esposto per l'utilizzo CLINICO di queste iPS.
confido che nei prossimi 10 anni Yamanaka con un paio d'altri vinceranno il nobel per le iPS. Sempre che si superino i problemi e le iPs entrino nella pratica clinica.

[laico79]

X lorekon
Effetivamente sono utilizzati antibiotici contro cellule eucariotiche e messi vettori che danno resistenza alle cellule che vengono trasformate.
Per risponderiti studio scienze biologiche e sto facendo tesi in biochimica-biologia molecolare. Detto ciò mi sono affacciato da appena un anno al mondo delle culture cellulari, per cui parlo per quello che so. Quello che non ho capito di questa storia e se sia necessario ottenere una linea stabile che produce pernamentemente questi fattori oppure dopo la regressione a cellule staminali si può interrompere la produzione di queste proteine, ecco perche parlavo di overespressione transiente. P.s. da quello che ho capito tu invece mi dai di genetista...

[Lorekon]

ah bene, allora siamo colleghi

che fai di bello per la tesi?


riguardo l'espressione dei fattori, penso che sia sotto un promotore "forte", anche se dovrei controllare (nei metodi non lo dice e uno dovrebbe scartabelare un pò)

[laico79]

Originariamente inviato da Lorekon

ah bene, allora siamo colleghi

che fai di bello per la tesi?


riguardo l'espressione dei fattori, penso che sia sotto un promotore "forte", anche se dovrei controllare (nei metodi non lo dice e uno dovrebbe scartabelare un pò)

La tesi credo che sarà sulla biogenesi mitondriale anzi quasi sicuramente.

[Lorekon]

lievito?

ADORO il profumo del lievito!