Come riprodurre terreni di coltura con "ingredienti" di facile reperibilità?

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da xenom

lol bella lì

cmq ho visto un video di cellule che esplodono per quantità troppo elevata di sale all'interno... poverine, però era figo

Ah! la pressione osmotica...

Aspettiamo l'autore così vediamo cosa dice del "pastone" per il piccolo chimico/botanico/biologo/biotecnologo

[Dr Nick Riviera]

Chiarisco un paio di concetti..
- non è necessario portare l'agar ne all'ebollizione ne vicino ad essa, basta metterlo in agitazione.. il calore cmq aiuta a solubilizzarlo..
- la sterilizzazione a 120°C per 20' o 121 °C per 15 min... è sottointeso che sia a 1 atm, perchè la pressione dipende dalla temperatura..
Cmq sia per i nutrienti così come per il sale.. basta seguire un protocollo.. anche se non è facile reperire tutte queste cose..
Nei lab ci sono già soluzioni stock che contengono tutti i microelementi, i macroelementi, ecc.. e le vendono così..

[Dr Nick Riviera]

Originariamente inviato da xenom

lol bella lì

cmq ho visto un video di cellule che esplodono per quantità troppo elevata di sale all'interno... poverine, però era figo

Per questo basta munirsi di un semplice microscopio.. e preparare 3 soluzioni:
ipotonica
isotonica
ipertonica

...dove ovviamente cambia la concentrazione di sale (la prima carenza di sale, la seconda concentrazione fisiologica e la terza un eccesso di sale) e vedi come le cellule vegetali reagiscono in modo diverso proprio per l'effetto osmotico..

[F1R3BL4D3]

Originariamente inviato da Dr Nick Riviera

Chiarisco un paio di concetti..
- non è necessario portare l'agar ne all'ebollizione ne vicino ad essa, basta metterlo in agitazione.. il calore cmq aiuta a solubilizzarlo..
- la sterilizzazione a 120°C per 20' o 121 °C per 15 min... è sottointeso che sia a 1 atm, perchè la pressione dipende dalla temperatura..
Cmq sia per i nutrienti così come per il sale.. basta seguire un protocollo.. anche se non è facile reperire tutte queste cose..
Nei lab ci sono già soluzioni stock che contengono tutti i microelementi, i macroelementi, ecc.. e le vendono così..

- beh certo però non puoi aspettare molto quando la prof ti alita sul collo....
- era per avere tutte le informazioni
- più che altro hai già protocolli

Giusto per sapere poi a cosa ti servirà il tutto...

[xenom]

Allora, prova con la gelatina al posto dell'agar, dovrebbe essere + semplice reperirla. Se sai già le concentrazioni dei vari ingredienti sei a posto
fai varie prove e poi dicci.

per lavorare in sterilità come fai? sei riuscito a fare la kappa a flusso laminare?
in alternativa lavora vicino al fornello di casa

[Dr Nick Riviera]

Raga.. i protocolli mi spuntano dagli orecchi ..sono all'ultimo anno di Uni..
Per la sterilità utilizzero proprio delle fiamme, è l'unica.. perchè senza filtri è inutile sparasi l'aria con i microrganismi addosso..
Cmq sia.. non ci farò niente di che.. solo la soddisfazione di essere riuscito a fare una cosa con mezzi propri che a regola fai solo in lab perchè devi avere delle certe condizioni.. sicuramente non avrò una buona resa nei risultati.. ma magari 1 piantina su 10 ci sta che non si inquini..

Cmq questa cosa mi sa che andrà un po' a lungo termine.. dato che sono in tesi e non la faccio nella mia città..

[NeroInferno]

Originariamente inviato da Dr Nick Riviera

Raga.. i protocolli mi spuntano dagli orecchi ..sono all'ultimo anno di Uni..
Per la sterilità utilizzero proprio delle fiamme, è l'unica.. perchè senza filtri è inutile sparasi l'aria con i microrganismi addosso..
Cmq sia.. non ci farò niente di che.. solo la soddisfazione di essere riuscito a fare una cosa con mezzi propri che a regola fai solo in lab perchè devi avere delle certe condizioni.. sicuramente non avrò una buona resa nei risultati.. ma magari 1 piantina su 10 ci sta che non si inquini..

Cmq questa cosa mi sa che andrà un po' a lungo termine.. dato che sono in tesi e non la faccio nella mia città..

Ciao,
mi sono iscritto al tuo forum, sto aspettando la conferma via email

Sto iniziando ad interessarmi nel campo della propagazione, solo che non trovo informazioni su come traslare tutto il processo nell'ambiente casalingo. In piu' non ho conoscenze di chimica, quindi non so come fare per formulare i terreni di coltura.

Fortunatamente ho esperienza con le colture grazie al mio hobby di coltiazione di eduli (funghi commestibili), e sono riuscito ad avere ottimi risultati in quanto a sterilità.

Sono del tuo pensiero, non e' assolutamente vero che si devono avere filtri hepa per avere una coltura sterile, si puo' fare tutto (ma piu' scomodamente) a casa. Io per esempio per le mie colture su MEA uso una semplicissima glovebox, che e' poco glove ma piu' box (e' una scatola di plastica con due buchi, riesco a tenere a bada i contaminanti con qualche spruzzata di alcool e qualche accorgimento). Ora ho comprato per lavorare in maggiore comodità un filtro HEPA(gigante!!! 91,5cm x 61 cm) e un ventilatore per costruire una cappa, ma non ho ne' tempo ne' soldi..

Dal mio hobby e' nato anni fa Free Spore Prints, la prima comunità mondiale per la distribuzione gratuita di impronte sporali (si paga solo 1€ o 2$ per il francobollo). Sto cominciando ora a raccogliere colture sterili da distribuire, ma ne distribuisco gia' di non sterili.

Purtroppo in italia siamo ancora troppi pochi a smanettare con le colture a casa, ne' c'e' un posto online per discutere e parlare. Se ti interessa possiamo parlare di un progetto futuro sulla micropropagazione, o meglio sulle colture in casa (non so' che termine si possa usare!!). Rendo disponibile FreeSporePrints.org o FreeSeedsRing.org in caso il progetto interessasse (anche perche' hanno sopratutto ha un pubblico internazionale). Ad ogni modo potrebbe nascerne qualcosa di veramente interessante e tosto

Intanto ecco qualche foto per far ricredere i dubbiosi

A presto,
Fabio

[The_Gabro]

Per le piante prova a cercare propagazione meristematica, è il nome della tecnica di propagazione su agar.
Per i microrganismi prova a vedere sto sito http://www.oxoid.com/UK/blue/index.asp?c=UK&lang=EN è la ditta da dove in uni da me prendiamo la maggior parte dei terreni. Ti guardi un terreno a tua scelta ci sono scritti i vari ingradienti con le quantità, io per esempio mi sto preparando a fare un brodo di coltura per batteri bioluminescenti.

[gianly1985]

Qua ci sono le schede tecniche di un casino di terreni:
http://www.condalab.com/user.php?op=...arts=A&lang=EN

L'ho consultato mentre studiavo Microbiologia...

[muso]

Originariamente inviato da NeroInferno

Ciao,
mi sono iscritto al tuo forum, sto aspettando la conferma via email

Sto iniziando ad interessarmi nel campo della propagazione, solo che non trovo informazioni su come traslare tutto il processo nell'ambiente casalingo. In piu' non ho conoscenze di chimica, quindi non so come fare per formulare i terreni di coltura.

Fortunatamente ho esperienza con le colture grazie al mio hobby di coltiazione di eduli (funghi commestibili), e sono riuscito ad avere ottimi risultati in quanto a sterilità.

A presto,
Fabio

VEcchio ifs?

Io usavo una pressure box e una glov con i guanti.
Usavo un filtro ULPA
L'agar si trova anche in negozi biologici.
Poi un uccellino mi regalo petri presterilizzate rosa.
Bei ricordi.

[NeroInferno]

Originariamente inviato da The_Gabro

Per le piante prova a cercare propagazione meristematica, è il nome della tecnica di propagazione su agar.
Per i microrganismi prova a vedere sto sito http://www.oxoid.com/UK/blue/index.asp?c=UK&lang=EN è la ditta da dove in uni da me prendiamo la maggior parte dei terreni. Ti guardi un terreno a tua scelta ci sono scritti i vari ingradienti con le quantità, io per esempio mi sto preparando a fare un brodo di coltura per batteri bioluminescenti.

Ciao, grazie della risposta. Interessante le colture dei batteri bioluminescenti, avevo trovato un sito dove spiegava tutta la tecnica, ma puoi farlo tranquillamente senza agar e piastre petri ma semplicemente un ampolla o una piccola bottiglia. A quanto ricordo bastava un gamberetto, dell'acqua e del sale..

Riguardo il sito ho visto molto velocemente ma mi sembra che ci siano scritte le varie sostanze chimiche..e per chi non conosce la chimica e'un po' dura ricostruire una ricetta con i materiali che si trovano comunemente in giro..o sbaglio? Ti interesserebbe scrivere un articolo con foto sull'esperimento che stai conducendo?

Originariamente inviato da gianly1985

Qua ci sono le schede tecniche di un casino di terreni:
http://www.condalab.com/user.php?op=...arts=A&lang=EN

L'ho consultato mentre studiavo Microbiologia...

Ciao, grazie della segnalazione. Interessantissimo sito, ma purtroppo come sopra ho difficoltà a ricostruire le ricette dei terreni di coltura con materiali che si trovano comunemente visto che non conosco la chimica. Se anche a te interessa l'idea della comunita' sulle colture sei il benvenuto come tutti gli altri.

Originariamente inviato da muso

VEcchio ifs?
Io usavo una pressure box e una glov con i guanti.
Usavo un filtro ULPA
L'agar si trova anche in negozi biologici.
Poi un uccellino mi regalo petri presterilizzate rosa.
Bei ricordi.

Ciao! se ti riferisci al vecchio forum non piu' esistente di FS, no non provengo da lì, vengo da Shroomery e poi ho continuato per la mia via aprendo FSP.

A quanto ho sentito dire la pressure box, se ti riferisci ad una autocostruita, e' inutile, peor' non sono mai entrato nel merito. Riguardo i filtri ULPA, sono uno spreco di soldi per chi come noi si sviluppa qualche coltura a casa..poi ovviamente dipende dagli usi, perche' un HEPA H13 ti permette di lavorare in tranquiliita' con colture di micelio e micropropagazione (io ho fatto lo sborone e ne ho comprato uno H14)..in caso vuoi lavorare con i virus (il che e' alquanto impossibile, credo) hai bisogno di filtri che filtrano contaminanti piu' piccoli come i virus, e hai bisogno degli ULPA.

Fortunatamente l'agar ce ne ho un kg o due kg nn ricordo, quindi avoglia a creare terreni di coltura :P

Le piastre petri uso quelle in pyrex ma appena ho soldi passo a quelle in plastica..

Come ho detto agli altri, se ti interessa l'idea di una comunità per le colture sei il benvenuto.

Ciao a tutti

[The_Gabro]

Originariamente inviato da NeroInferno

Ciao, grazie della risposta. Interessante le colture dei batteri bioluminescenti, avevo trovato un sito dove spiegava tutta la tecnica, ma puoi farlo tranquillamente senza agar e piastre petri ma semplicemente un ampolla o una piccola bottiglia. A quanto ricordo bastava un gamberetto, dell'acqua e del sale..

Sono batteri simbionti di pesci e altre bestie marine si trovano con facilità.

Originariamente inviato da NeroInferno

Riguardo il sito ho visto molto velocemente ma mi sembra che ci siano scritte le varie sostanze chimiche..e per chi non conosce la chimica e'un po' dura ricostruire una ricetta con i materiali che si trovano comunemente in giro..o sbaglio?

Anche un chimico nn riesce a trovare comunemente in giro alcuni ingredienti anche sapendo cosa siano. Sfido chiunque a trovare al supermercato fibrinogeno di coniglio e tellurito di potassio, due ingredienti per un terreno chiamato Baird Parker. Tieni presente però che i terreni specialmente quelli selettivi sono stati studiati per favorire al massimo la crescita di particolari specie batteriche sfavorendo tutte le altre. Se tu vuoi fare un terreno generico basta una fonte di C, una di N e incubare il tutto a una temperatura giusta, i batteri nn sono così fighetti da nn crescere se nn si trovano in condizione perfette. Anzi al contrario sono delle bestie dell'adattamento (non tutti è chiaro).

Originariamente inviato da NeroInferno

Ti interesserebbe scrivere un articolo con foto sull'esperimento che stai conducendo?

Mi manca l'incubatore, devo trovare un vecchio frigo, altrimenti nn ci faccio niente. Il terreno so come farlo e anche come ottenere una sommaria sterilità. Se vuoi posso dirti fino a qui.

Ciauz

[NeroInferno]

Originariamente inviato da The_Gabro

Mi manca l'incubatore, devo trovare un vecchio frigo, altrimenti nn ci faccio niente.

Per l'incubatore puoi usare il semplicissimo metodo delle scatole di plastica della stessa dimensione una sopra l'altra, e nell'intercapedine mettere acqua e una serpentina per acquari (in caso ti servano 20-30°C)...e chiudere la scatola di plastica superiore con un coperchio se hai bisogno di buio.

Il terreno so come farlo e anche come ottenere una sommaria sterilità. Se vuoi posso dirti fino a qui.

Si magari! Per la sterilità usa una glovebox (vedi anche qui) che funziona alla grande (io continuamente risultati di sterilità al 100%). Unico consiglio non metterci i guanti (ma usa quelli monouso senza ancorarli alla glovebox, passandoci prima un po' di volte alcool una volta indossati), se ci riesci falla piu' profonda e con i buchi piu' larghi, cosi' lavori meglio e imprechi di meno :P

Se poi non vuoi stare a spendere soldi, va' benissimo un cartone ritagliato e rivestito come vedi nella seconda foto. Ti premetto che so per certo che queste due glovebox che vedi funzionano perche' la prima e' la mia e la seconda e' di cari amici..

Riguardo invece alla formulazione dei terreni di crescita, che consigli?

Grazie.

[The_Gabro]

Mi servono temperature di 12-15°C per questo sto cercando un frigo. Veramente bella l'idea della camera sterile la prenderò in seria considerazione.

composition
ammonium chloride, 0.3 g/L
calcium carbonate, 1 g/L
casein enzymic hydrolisate, 5 g/L
ferric chloride, 0.01 g/L
magnesium sulfate, 0.3 g/L
monopotassium dihydrogen phosphate, 3 g/L
sodium chloride, 30 g/L
sodium glycerophosphate, 23.5 g/L
yeast extract, 2.5 g/L
final pH
7.0±0.2 (25 °C)
Questa è la composizione del brodo di coltura tipo per la crescita di batteri del genere Photobacterium. Io l'ho rivista così:
1 L di acqua di mare con la sua concentrazione salina che nn andrò a modificare
come idrolizzato enzimatico di caseina prenderò un formaggio magro a lunga stagionatura
per l'estratto di lievito metto un panetto di lievito di birra in acqua e lo faccio bollire per 10 minuti
infine ci aggiungo del glicerolo
il pH lo misuro con cartine al tornasole

Per un terreno generico così su due piedi mi è venuta questo: acqua distillata, cloruro di sodio, glucosio, urea. Al posto dell'urea puoi aggiungerci magari del siero di latte ecc...

[NeroInferno]

riguardo l'inoculazione invece?

cloruro di sodio e urea a cosa servirebbero nel brodo di coltura?

grazie.

[The_Gabro]

Il cloruro di sodio serve a mantenere l'osmolarità, l'urea è una fonte di N inorganico. Cosa vuoi sapere riguardo all'inoculo?!

[NeroInferno]

Per quello che ricordo, riguardo le colture di batteri luminescenti bastava tenere in una vaschetta un gamberetto coperto per meta' dall'acqua, per 4 giorni, dopo di che si sarebbe effettuato l'inoculazione tramite comune prelevamento di campione di acqua su terreno di coltura..procedi cosi' o come?

Riguardo la ricetta generale, ti riferisci a un brodo di coltura generale per qualsiasi uso o cosa? Pensi che l'uso di gentamicina per fermare l'avanzata dei batteri puo' creare problemi alle colture micropropagate?

grazie

[The_Gabro]

Originariamente inviato da NeroInferno

Per quello che ricordo, riguardo le colture di batteri luminescenti bastava tenere in una vaschetta un gamberetto coperto per meta' dall'acqua, per 4 giorni, dopo di che si sarebbe effettuato l'inoculazione tramite comune prelevamento di campione di acqua su terreno di coltura..procedi cosi' o come?

No, io userò del pesce lasciato ad una temperatura di circa 10-12°C per almeno due giorni. Nn appena noterò una sospetta luminescenza preleverò un'ansata e la inoculerò nel brodo. Se crescerà il batterio da me richiesto farò ancora due passaggi per cercare di "purificare" il più possibile la coltura. Dopodichè partirò con la coltura vera e propria.

Originariamente inviato da NeroInferno

Riguardo la ricetta generale, ti riferisci a un brodo di coltura generale per qualsiasi uso o cosa? Pensi che l'uso di gentamicina per fermare l'avanzata dei batteri puo' creare problemi alle colture micropropagate?

grazie

E' un brodo di coltura abbastanza generico, nel senso che dato che come fonte di N c'è l'urea cresceranno solo quei microrganismi in grado di organicare l'N inorganico. I lieviti mi pare che riescano così come la flora degradativa.
Sulla gentamicina nn so dirti niente mi dispiace.

[xenom]

Originariamente inviato da The_Gabro

Sono batteri simbionti di pesci e altre bestie marine si trovano con facilità.



Anche un chimico nn riesce a trovare comunemente in giro alcuni ingredienti anche sapendo cosa siano. Sfido chiunque a trovare al supermercato fibrinogeno di coniglio e tellurito di potassio, due ingredienti per un terreno chiamato Baird Parker. Tieni presente però che i terreni specialmente quelli selettivi sono stati studiati per favorire al massimo la crescita di particolari specie batteriche sfavorendo tutte le altre. Se tu vuoi fare un terreno generico basta una fonte di C, una di N e incubare il tutto a una temperatura giusta, i batteri nn sono così fighetti da nn crescere se nn si trovano in condizione perfette. Anzi al contrario sono delle bestie dell'adattamento (non tutti è chiaro).



Mi manca l'incubatore, devo trovare un vecchio frigo, altrimenti nn ci faccio niente. Il terreno so come farlo e anche come ottenere una sommaria sterilità. Se vuoi posso dirti fino a qui.

Ciauz

il tellurito è contenuto nel tuorlo d'uovo.
Ho usato il baird parker con tuorlo d'uovo in addizione.

Volendo si trova tutto, il problema è mescolare i componenti nelle giuste proporzioni...

[The_Gabro]

Originariamente inviato da xenom

il tellurito è contenuto nel tuorlo d'uovo.
Ho usato il baird parker con tuorlo d'uovo in addizione.

Volendo si trova tutto, il problema è mescolare i componenti nelle giuste proporzioni...

Ma no anzi se vai nei siti delle case che forniscono i terreni ci sono scritte le composizioni con le concentrazioni.
Qui http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_de...1&c=UK&lang=EN è descritto il BP e qui http://www.sigmaaldrich.com/catalog/...il/FLUKA/75208 c'è la ricetta del supplemento egg yolk.