[bio] costante di michaelis menten

[walter sampei]

ragassss, problema: in laboratorio ci hanno fatto fare l'esperienza in cui bisogna trovare la km per un enzima mediante misure allo spettrofotometro.

ok, ho fatto l'esperimento, preso nota dei valori, e fatto la mia bella tabella con le misure di assorbanza. pensavo di usare la legge di lambert-beer per passare alle concentrazioni, ma mi manca il coefficiente di estinzione molare, per cui in quel modo non se ne esce. idee e consigli, o magari formule da applicare?

(lo ammetto, sono un caso disperato in laboratorio, mi trovo decisamente meglio a mettere le zampacce sulla malcapitata bestia di turno!!!)

[shawn89]

Ciao, il coefficiente di estinzione molare non è altro che l'assorbanza della soluzione 1M del composto che hai misurato. Infatti:

A (assorbanza) = € (coeff.estinzione mol.) * l (cammino ottico) * c (concentrazione soluzione)

l è una costante perchè in tutti gli spettrofotometri le cuvette sono standard, quindi 1cm. Ora, ponendo la concentrazione della sostanza anch'essa uguale a 1, risulta infatti che € è uguale all'assorbanza. Dal momento che questa è adimensionale, € viene è espressa in [cm^-1 * M^-1].
Quindi il coefficiente di estinzione molare è sì una costante, ma che va calcolata per ogni esperimento perchè dipende dal composto che analizzi.

Premetto che il laboratorio di biochimica devo ancora farlo (ce l'ho a gennaio ) però non ho ben capito a che ti serve applicare la L-B. In teoria il grafico dovresti costruirlo con misure di campioni a concentrazioni note da cui tracci una retta di calibrazione che poi usi per ricavare le [] dei tuoi campioni.

[Dawidh]

Originariamente inviato da walter sampei

ragassss, problema: in laboratorio ci hanno fatto fare l'esperienza in cui bisogna trovare la km per un enzima mediante misure allo spettrofotometro.

ok, ho fatto l'esperimento, preso nota dei valori, e fatto la mia bella tabella con le misure di assorbanza. pensavo di usare la legge di lambert-beer per passare alle concentrazioni, ma mi manca il coefficiente di estinzione molare, per cui in quel modo non se ne esce. idee e consigli, o magari formule da applicare?

(lo ammetto, sono un caso disperato in laboratorio, mi trovo decisamente meglio a mettere le zampacce sulla malcapitata bestia di turno!!!)

Ciao, ho da poco fatto lo stesso esperimento. Già fatta la relazione e già corretta dai prof.
Allora per ricavarti il coefficiente avresti dovuto (magari lo hai anche fatto) fare una misura dell'assorbanza a reazione finita..noi l'abbiamo fatta 2 giorni dopo quando siamo tornati in lab...per ogni campione alle varie concentrazioni.

Poi grafichi assorbanza su concentrazione substrato, calcoli il coefficiente angolare della retta di regressione, che per la legge di L-B corrisponde a epsilon * cammino ottico e infine per la stessa legge ti calcoli la concentrazione con C = A/(epsilon*l)

trasformi tutte le assorbanza in concentrazione e ti puoi trovare la velocità di reazione in relazione alla concentrazione etc etc.

Se non riesci a ricavarti la epsilon in questo modo l'unica alterantiva è cercare il valore del coefficiente di estinzione molare in letteratura, quindi in qualche ricerca (ovviamente controllando che siano state usate le stesse condizioni fisico/chimiche, soprattutto per la temperatura)

[shawn89]

Neanche farlo apposta ho fatto pure io questo esperimento questa settimana. A noi hanno fatto purificare la fosfatasi alcalina di Coli.
Ammetto di aver ancora le idee un po' confuse, devo ancora preparare le relazioni comunque sono certo che il coefficiente di estinzione molare ce l'hanno dato le prof (era 17 mM^1*cm^-1) .
La Km l'abbiamo calcolata col grafico dei doppi reciproci facendo misure successive allo spettrofotometro di 5 soluzioni con [] di substrato crescenti mentre [fosfatasi alcalina] restava costante.

[walter sampei]

Originariamente inviato da shawn89

Neanche farlo apposta ho fatto pure io questo esperimento questa settimana. A noi hanno fatto purificare la fosfatasi alcalina di Coli.
Ammetto di aver ancora le idee un po' confuse, devo ancora preparare le relazioni comunque sono certo che il coefficiente di estinzione molare ce l'hanno dato le prof (era 17 mM^1*cm^-1) .
La Km l'abbiamo calcolata col grafico dei doppi reciproci facendo misure successive allo spettrofotometro di 5 soluzioni con [] di substrato crescenti mentre [fosfatasi alcalina] restava costante.

direi non male

[Lorekon]

Originariamente inviato da walter sampei

ragassss, problema: in laboratorio ci hanno fatto fare l'esperienza in cui bisogna trovare la km per un enzima mediante misure allo spettrofotometro.

ok, ho fatto l'esperimento, preso nota dei valori, e fatto la mia bella tabella con le misure di assorbanza. pensavo di usare la legge di lambert-beer per passare alle concentrazioni, ma mi manca il coefficiente di estinzione molare, per cui in quel modo non se ne esce. idee e consigli, o magari formule da applicare?

(lo ammetto, sono un caso disperato in laboratorio, mi trovo decisamente meglio a mettere le zampacce sulla malcapitata bestia di turno!!!)

ovviamente dovevi fare una curva di taratura allo spettrofotometro con diluizioni successive del prodotto da misurare.

la Km del titolo poi non c'entra una mazza con la domanda che poni nel 3d.

[Lorekon]

Originariamente inviato da shawn89

In teoria il grafico dovresti costruirlo con misure di campioni a concentrazioni note da cui tracci una retta di calibrazione che poi usi per ricavare le [] dei tuoi campioni.

esatto.

cmq alcune cuvette (per DNA) hanno il cammino ottico da 5 mm

[walter sampei]

Originariamente inviato da Lorekon

ovviamente dovevi fare una curva di taratura allo spettrofotometro con diluizioni successive del prodotto da misurare.

la Km del titolo poi non c'entra una mazza con la domanda che poni nel 3d.

questo l'avevo notato anche io, ci hanno fatto fare questa cosa assurda... viva l'unipd

Originariamente inviato da Lorekon

esatto.

cmq alcune cuvette (per DNA) hanno il cammino ottico da 5 mm

pensavo che ci fossero solo quelle da 1 cm...