diafino
13-02-2009, 02:22
Posto come sempre alcuni miei appunti del corso che ho seguito circa la Resistenza Antibiotica. Magari a qualcuno possono servire..
Antibiotici
I batteri sono organismi dell'ordine di 1-10 micron.La pelle separa il mondo esterno dai tessuti interni che devono essere sterili.I microrganismi entrati nell'organismo provocano infezioni es.clostridium tetani,clostridium botulinum,clostridium difficile, staphylococcus aureus, ecc.
la superficie del nostro corpo e'rivestita da batteri che costituiscono la flora batterica.Quindi il battere che supera le barriere fisiche e quelle immunitarie puo' provocare infezioni.
Le infezioni possono insorgere in vari organie per curarle si usano gli antibiotici.Gli antibiotici sono farmaci che servono a curare processi infettivi provocati da batteri che si trovano in luoghi in cui non si devono trovare.Gli antibiotici sono metaboliti secondari di basso peso molecolare prodotti da batteri e funghi capaci di inibire a basse concentrazioni(nell'ordine di micron/ml) la crescita di altri microrganismi.
Alcuni microrganismi nelle loro vie anaboliche possono sintetizzare quella molocola che il microrganismo non ha nell'ovvia funzione (= metabolita secondario).
La posologia dovra' portare nei termini corporei opportune concentrazioni che percio' devono essere piccole e in grado di inibire la crescita di microrganismi.I funghi e i batteri che creano antibiotici sono alcuni.
Fleming coltivo'una piastra di Petri che si inquino' di una muffa ed intorno ad essa le colo nie batteriche non crebbero.Si tratta di penicillum,un fungo che e' in grado di provocare la inibizione del batterio staphylococcus aureus,Tale sostanza era la penicillina.Si e' poi visto che la penicillina era in grado di curare infezioni mortali.
Porto' una rivoluzione importante nella cura dei processi infettivi.
Pero' la penicillina come gli altri antibiotici non era in grado di uccidere tutti i batteri ma solo i gram+ e alcuni gram-.Quindi nacque la ricerca e lo sviluppo di nuovi antibiotici per ricercare altri antibiotici in grado di uccidere : :griseofulvina,cloramfenicolo,streptomicina,neomicina,rifampicina,gentamicina,vancomicina,eritromicina.Dagli anni30 agli 80 sono stati scoperti tanti antibiotici.
1)quindi gli antibiotici sono molecole naturali
2)un antibiotico naturale ha limitazioni d'uso: es. la penicillina non faceva nulla per os perche' era intaccata dal succo gastrico ed era attva solo iniettabile.Il compito dei chimici farmaceutici era quello di migliorare le caratteristiche farmaceutiche della penicillina in modo da renderla resistente anche per os.Nacquero cosi'gli antibiotici SEMISINTETICI cioe' derivati da molecole naturali ma modificate.
3)le molecole sono piccole.Allora e' parso piu'conveniente per alcuni antibiotici sintetizzare la molecola in laboratorio copiandola dal modello naturale.
4)ci sono poi dei chemioterapici antimicrobici,( come es. i sulfamidici),sintetizzati in laboratorio non esistenti in natura,es.sulfamidici,chinoloni,trimetoprim.
Quindi gli ANTIBIOTICI possono essere:
1)naturali
2)semisintetici
3)sintetici
4)chemioterapici antimicrobici.
Gli antibiotici piu'USATI sono di 160 tipi:
70 :cefalosporine,derivate da cefalosporina C
50 :penicilline, derivate da penicillina G
12 : tetracicline,la via semisintetica e' molto importante perche'permette di creare antibiotici attivi modificando quelli non piu' attivi
9 : macrolidi
8 :aminoglicosidi
3 :carbapemi
BERSAGLI degli antibiotici:
antibatterici attivi contro i batteri
antifungini attivi contro i funghi, ma inattivi contro i batteri
antiprotozoari attivi contro i protozoi
antivirali attivi contro i virus
poi:
antitumorali
immunosoppressivi
Infatti alcuni microrganismi producono molecole naturali che hanno una diversa attivita'farmacologica e che sono attivi sui tumori( es doxamicina) o contro il sistema immunitario nei rigetti (es ciclosporine).
Quindi i microrganismi sono una grande sorgente di molecole farmacologiche.
CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE (MIC)
MIC= minima concentrazione a cui un antibiotico e' in grado di inibire un microrganismo.E' importante per stabilire la POSOLOGIA cioe' quanto devo somministrare per ottenere una certa concentrazione in un tessuto ,maggiore della MIC.
Il rispetto della posologia e' fondamentale.
DETERMINAZIONE DELLA MIC
Come si determina? avro' un antibiotico e un microrganismo,si prendono delle provette contenenti terreno maximo liquido poi aggiungo il microrganismo e quantita' crescenti di antibiotico.Pongo le provette in termostato,osservo la crescita batterica:se il micorganismo non e' inibito il terreno si intorbidisce.Viceversa se il terreno non e' torbido vuol dire che la crescita cellulare e'distrutta.La MIC sara' la concentrazione di antibiotico corrispondente a quella provetta campione che contiene il piu' basso contenuto di antibiotico. Quindi dovro' somministrare una quantita' di antibiotico che permette di raggiungere una concentrazione maggiore o uguale alla MIC.OvViamente bisogna tenere conto delle caratteristiche chimico fisiche e farmacocinetiche dei farmaci.
A QUESTO PUNTO MI DOMANDO:
L'antibiotico ha inibito la moltiplicazione batterica (batteriostatico)o ha ucciso i microrganismi(battericida)?
Vado a prelevare dalle provette limpide 0,1ml e lo pongo in un terreno di coltura:se ho crescita vuole dire che l'antibiotico e' batteriostatico se viceversa non c'e' crescita vuole dire che l'antibiotico e'battericida.
Attivita'battericida:
betalattamici (cefalosporine, penicilline)
rifampicina
Attivita'batteriostatica:
cloramfenicolo
sulfamidici
Gli antibiotici vengono saggiati su vari microorganismi,ognuno e' indicato con una sigla, che indica la collezione
es.ATCC,american type colture collection,per avere risultati ripetibili.I saggi biochimici per identificare i microrganismi danno risultati diversi percio' si usano ceppi di collezione, che sono caratterizzati da batteri tutti eguali.
Quando vado a usare un antibiotico per una infezione, posso essere sicuro che la MIC indicata inibisce qualsiai tipo di battere con quel nome?NO ,perche' la MIC di un antibiotico vale solo per quel ceppo preso in esame:quindi ogni antibiotico va testato su piu' ceppi diversi ma della specie batterica presa in esame.Le infezioni sono fatte da microrganismi "selvatici".Ogni opedale ha un laboratorio che analizza microrganismi realmente implicati nelle patologie.La dose realmente efficace su un microrganismo e' detta " MIC90 ".Gli antibiotici vengono testati su
DIVERSI CEPPI di una specie e ottengo varie MIC. DEFINIZIONE di " MIC90": e' la concentrazione necessaria per inibire almeno il90% dei ceppi di una stessa specie.La MIC90 garantisce quindi il 90% delle guarigioni.
SPETTRO DI AZIONE DI UN ANTIBIOTICO
E'l'insieme dei microrganimi che possono essere trattati con quel antibiotico.Gli antibiotici sono molto selettivi, esempio FLOBACIN (chinolone) ha principio attivo la floxacina un antibatterico attivo contro i gram+ e gram- e la MIC90 e' testata su diversi ceppi di una stessa specie.
Le infezioni nosocomiali sono quelle prese in ospedale.Piu' alto e' il valore della " MIC90" piu' efficace la terapia contro quel microbo e minori sono gli effetti collaterari.Bisogna inoltre essere sicuri che una certa patologia sia sostenuta da quel microrganismo = es.FLOBACIN e' indicato nelle vie respiratorie, e per ogni patologia e'indicata anche la %ale di guarigione.
La posologia dell'antibiotico e'stabilita in modo da ottenere una concentrazione uguale o maggiore della MIC90 in modo da ottenere una buona % di successi perche' l'antibiotico e' gia' stato testato su diversi ceppi della stessa specie.
Gli antibiotici beta-lattamici(cefalosporine, penicilline) sono attivi a livello della SINTESI DEI PEPTIDOGLICANI
e non sono attivi sui micoplasmi(batteri senza parete cellulare).
L'antibiotico non e' attivo verso quei microrganismi non inclusi nello spettro.
In base a cio' gli antibiotici vengono divisi:
ad AMPIO spettro, agiscono su molti microrganismi es. tetracicline
a STRETTO spettro , agisono su pochi microrganismi specifici es.tobramicina.
Gli antibiotici ad ampio spettro si danno per il pronto intervento ma spesso questi hanno una maggiore tossicita'perche' uccidono anche la flora batterica (es. intestinale).La flora quindi si squilibra provocando infezioni particolari :nei bambini se si abusa in antibiotici permane il Clostridium difficile che puo' provocare anche la morte.
RESISTENZA ANTIBIOTICA
alcuni microeganismi nel tempo possono diventare resistenti all'antibiotico a cui erano sensibili.Un microrganismo resistente e' geneticamente modificato perche'l'antibiotico ha permesso la sopravvivenza di quel ceppo,prima sensibile.Poi si e' andati verso ad un aumento di concentrazione.Oggi la penicillina non e' piu' attiva verso lo Stafilococcus aureus perche' si e' diffuso un ceppo resistente. E' naturalmente essenziale scegliere l'antibiotico giusto.
ANTIBIOGRAMMA
E' lo spettro d'azione cioe' l'insieme dei microrganismi sensibili ad un antibiotico .L'antibiogramma cambia con il tempo :cioe' ceppi appartenenti a una specie sensibile ad un determinato antibiotico possono poi manifestare resistenza.Si possono incontrare ceppi che diventono resistenti nel tempo,percio' ci sono consequenze :
-spettro d'azione e' variabile (aumentano i ceppi resistenti)
-l'associazione antibiotico/microrganismo non e' sempre valida cambia qualche cosa nel microrganismo, cambia in senso GENETICO ma non perche'e' venuto a contatto con l'antibiotico,questo giustifica il fatto perche' la tubercolosi sta ritornando.
Per risolvere il problema dell'antibiotico giusto si ricorre all'ANTIBIOGRAMMA;nei confronti del microrganismo responsabile del processo infettivo si saggia qual'e' l'antibiotico attivo; si fa prelievo del microrganismo dalle feci o dalle urine e lo si isola in un terreno di coltura massimo : noi non sappiamo quale e' il microrganismo,si prende una singola colonia e la si pone in un terreno di coltura e si vede il microrganismo crescere.Si prende un timbro costituito da tanti cilindretti con dentro dei dischetti impregnati di antibiotici reputati piu'efficaci ....
poi faccio cadere i dischetti sulla piatra contenente il microrganismo.L'antibiotico diffonde nell'agar e man mano inibisce la crescita del microrganismo intorno ai dischetti formando degli aloni di inibizione; il risultato e' l'antibiogramma ma insieme si saggia anche l'efficacia degli antibiotici,Cosi' si sceglie il giusto antibiotico in base al diametro dell'alone di inibizione e delle caratteristiche del paziente.Limite :
OCCORRE TROPPO TEMPO,circa due giorni,e non si puo' intervenire per le emergenze;si agisce per esperienza e si puo' utilizzare questo metodo per confermare l'effettiva efficacia dell'antibiotico che ho scelto.
Di fronte a un quadro clinico e' difficile scegliere un antibiotico.Come si fa a sceglierlo?
-per le emergenze si fa una terapia EMPIRICA cioe' mi posso basare solo sull'esperienza clinica usando l'antibiotico che ha la maggiore probabilita'di attivita'sul microrganismo patogeno ipotizzato come responsabile; posso utilizzare un antibiotico ad AMPIO SPETTRO che ha maggiore probabilita' di successo.L' antibiogramma mi permette di sapere se l'antibiotico usato e' veramente efficace.
-per la terapia non urgente,si fa la TERAPIA MIRATA E DEFINITIVA.Si fal'isolamento del microrganismo e l'antibiogramma,si usa l'antibiotico a spettro stretto.
L'ANTIBIOTICO dopo un po' di tempo non funziona piu'perche' diventa resistente, subisce un cambiamento genetico.La conoscenza di questa resistenza indirizza la ricerca di nuovi antibiotici,particolarmente dei derivati semisintetici.
MECCANISMO D'AZIONE DEI DISINFETTANTI E DEGLI ANTIBIOTICI
DISINFETTANTI,hanno spettro a 360°,
non sono selettivi, possono essere nocivi anche per le cellule dell'organismo.
ANTIBIOTICI,ognuno ha il suo spettro,
sono selettivi,cioe' capaci di agire ,colpire con azio battericida e batteriostatica solo sui microrganismi SENSIBILI interferendo il meno possibile con le cellule dell'organismo.Per esempio i beta-lattamicisono i piu' importanti a livello chimico(= penicilline e cefalosporine)sono selettivi perche' colpiscono la parete batterica cioe' inibiscono la biosintesi della parete cellulare,struttura essenziale per la vita dei batteri.
Tutti i bersagli degli antibiotici devono essere funzioni essenziali dei microrganismi.I beta-lattamici sono selettivi perche' solo i batteri hanno la PARETE CELLULARE.
Una volta compreso il meccanismo d'azione si puo' comprendere il proprio meccanismo di azione proprio a differenza dei disinfettanti.
Gli antibiotici possono inibire una importante funzione cellulare dei batteri:
-biosintesi della parete cellulare
-sintesi del DNA batterico
-sintesi DELL'RNA batterico
-sintesi proteica (e'il piu'complesso processo biochimico cellulare)
-vie metaboliche essenziali.
In caso di resistenza si puo' trovare una strategia alternativa.
1)INIBITORI DELLA BIOSINTESI del PEPTIDOGLICANO (beta-lattamici)
Il peptidoglicano e' un componente essenziale della parete cellulare presente in tutti i batteri tranne i micoplasmi.E' formato da una parte peptidica e una zuccherina. E' PRESENTE SIA NEI GRAM+ ( PIU' CONSISTENTE) SIA NEI GRAM- (PIU' SOTTILE). E' costituito da tanti fili che devono essere uniti per dare rigidita'.
I filamenti sono zuccherini(n-acetilglucosamina e n-acetilmuramico).
Al NAM e' legata una catena amminoacidica che unisce i vari filamenti attraverso legami diretti nei GRA-, oppure con interposizione di" 5 Gly-" nei GRAM+ tra le catene amminoacidiche.Se non ci sono tali legami la parete non e' piu' rigida.Nei punti in cui si forma il legame con le "5 Gly" c'e' una D-alanina
.La rigidita'e' data dal legame che avviene tra catene aminoacidiche,legame che puo' essere:
-diretto nei GRA-
-indiretto con l'interposizione di 5Gly nei GRAM+ . La D-alanina che lega 5 Gly e' legata ad una altra D-alanina,l'enzima TRANSPEPTIDASI stacca il legame tra le D-alanine (l'ultima D-alanina) per creare il legame tra D-alanina rimasta e la Gly-.
A livello del citoplasma si formano i precursori: da un lato c'e' una via metabolica che porta a NAG,l'altra produce NAM (cui e' legata la catena degli aminoacidi). C'e' una proteina di trasporto che trasporta il precursore di NAM e durante il trasporto NAM si lega a NAG, il nuovo mattone si attacca a quelli gia' presenti e permette l'accrescimento della parete.
Non solo i beta-lattamici ma anche la cicloserina, bacitracina,vancomicina intervengono a livello della biosintesi:
la vancomicina impedisce l'inserimento di nuovi mattoni,
la bacitracina inibisce il trasporto,
la cicloserina impedisce la sintesi di D-alanina (uguale non c'e' piu' il precursore) impedendo l'attivita' di racemasi(L-alanina che diventa D-alanina):
D-cicloserina si attacca al sito attivo dell'enzima con legame debole perche' ha una struttura simile alla D-alanina.
GLI ANTIBIOTICI SI LEGANO A UNO SPECIFICO BERSAGLIO,impedendone la funzionalita'.
I beta-lattamici hanno un anello betalattamico, questa struttura non si puo' modificare altrimenti non funziona piu'.
Posso interferire chimicamente solo sulla catena R ,nelle penicilline esiste una catena R,nelle cefalosporine ci sono 2 catene R,PERCIO' HO PIU' POSSIBILITA' DI INTERVENIRE perche'hanno piu' gruppi R, vedi esempio:
La penicillina G era solo iniettabile ,perche' non e' gastroresistente.
I derivati semisintetici con che logica vengono ricercati? si cerca di migliorare sia lo spettro d'azione sia
la farmacocinetica.
esempio : la penicillina G non era somministrabile per via orale,instabile alle betalattamasi dello Staphylococcus aureus e non era attiva sui GRAM-.Il primo arrivato l'AMPICILLINA ERA SOMMINISTRABILE PER VIA ORALE ED ERA ATTIVA ANCHE SUI GRAM-,USATISSIMA PER LA TERAPIA EMPIRICA.
i nomi iniziano per "cefo".
Gli antibiotici inibitori servono a bloccare la sintesi del setto ,provocano un rigonfiamento al centro. ATTENZIONE
SONO SEMPRE BATTERICIDI.Il rigonfiamento dovuto al trattamento con i beta-lattamici e' dovuto al fatto che i batteri
si riproducono per scissione e perdono la struttura rigida del peptidoglicano; se la parete perde la
rigidita',l'H2O dall'esterno non e' piu' trattenuta ,entra nella cellula per osmosi cosi' la cellula scoppia e
muore.
L'enzima transpepidasi e' responsabile della formazione del legame covalente tra le 2 catene laterali(tra la D-alanina e la Gly).Le penicilline possono inibire questo enzima: da un punto di vista stereochimico la penicillina e' molto simile al dimero D-alanil-D-alanina quindi la penicillina si puo' attaccare al sito attivo della transpeptidasi che non funziona piu'.La transpeptidasi ha 2 siti attivi che riconosce i 2 peptidoglicani da unire.
I beta-lattamici diminuiscono la biosintesi del peptidoglicano ;il piu'probanile bersaglio e' la transpeptidasi.E' stata usata penicillina radioattiva,poi si purifica la proteina di membrana tramite SDS (= elettroforesi su gel agarosio,se e' vero che il bersaglio della penicillina e' la transpeptidasi(che ce ne' solo una),la penicillina dovrebbe legarsi ad una sola banda(creata dalle proteine)cioe' quella della transpeptidasi;si fa una lastra fotografica:si vede che la penicillina si e' legata a 5-6 bande(=penicillin binding proteins) cioe' si lega a piu' proteine PBP perche' esistono piu'enzimi che intervengono nella sintesi della parete:endopeptidasi che rompono i legami e permettono la creazione di spazio per aggiungere nuovo peptidoglicano.
Esiste un enzima poi che toglie la D-alanina finale ; QUINDI CI SONO PIU'ENZIMI CHE INTERVENGONO NELLA BIOSINTESI del peptidoglicano e che riconoscono il dimero D-alanil-D-alanina.
Penicilline e cefalosporine hanno lo stesso meccanismo d'azione.
SELETTIVITA' DEI BETA-LATTAMICI :inibiscono la biosintesi della parete cellulare al contrario dei disinfettanti che non hanno attivita' specifica,ricorda che le cellule umane non hanno parete cellulare.
CARATTERISTICHE BIOLOGICHE COMUNE AGLI INIBITORI DELLA BIOSINTESI DEL PEPTIDOGLICANO
sono attivi solo sulle cellule in fase di crescita,cioe' su quelle che stanno sintetizzandola parete.
La terapia deve essere intermittente, cioe' a certi intervalli di tempo .Se ho una concentrazione inferiore alla MIC mentre le cellule batteriche si stanno dividendo non tutte vengono uccise, ma le cellule che sopravvivono vengono uccise nel prossimo picco. Da ricordare che i beta-lattamici sono inattivi sui batteri privi di parete cellulare come i micoplasmi e sono generalmente BATTERICIDI. Sono altamente selettivi,ma hanno effetti collaterali tra cui il piu' importante e' l'allergia e sapere se si e' allergici e' importante per un eventuale trattamento ospedaliero.
ANTIBIOTICI INIBITORI DELLA SINTESI MACROMOLECOLARE DI DNA E RNA
esempio DAUNOMICINA,ETIONIO BROMURO,FECOMICINA ?
non sono selettivi perche' intervengono anche sul DNA e RNA delle cellule umane.....percio' sono usati come antitumorali dal momento che si legano a cellule che si dividono rapidamente.
Pero' sono essi stessi cancerogeni ma il rapporto rischio / beneficio e' basso.
Esistono antibiotici che si legano a enzimi responsabili della sintesi di DNA batterico e sono chemioterapici antimicrobici: i chinoloni esempio acido nalidixico usato per le infezioni alle vie urinarie, da cui sono stati sintetizzati numerosi derivati come acido pipemidico , acido oxocinico, norfloxacin,gloxacin ,ciprofloxacin .enoxacin.....tutti i derivati chemioterapici terminano in oxacin.Bloccano la sintesi del DNA BLOCCANDO LA REPLICAZIONE cioe' bloccano la DNA-girasi umana che e' diversa da quella batterica (differente e' affinita' per il bersaglio che e' uno dei meccanismi di selettivita' piu' diffusi; esempio ciproxin cioe' ciprofloxacin abbassa DNA- GIRASI BATTERICA.
RIFAMPICINA
inibisce l'enzima che sintetizza m-RNA ( RNA polimerasi), legandosi alla sua subunita' beta ,quindi la sintesi proteica crolla. E' un meccanismo di selettivita': la RNA-polimerasi umana e' un po' diversa. ( esempio rifocin ).
Effetti collaterali: induttore del citocromo P 450, interferendo con l'eliminazione di altri farmaci ( es contraccettivi orali).
ANTIBIOTICI INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA
Si attaccano ai ribosomi (70S) e' meccanismo di selettivita' perche' i ribosomi umani sono piu' grandi (80s).
Ci sono 2 casi
-1 ) si legano alla sub 30S es.streptomicina,tetraciclina,gentamicina ( struttura aminoglicosidica).
-2 ) si legano alla sub 50S es. cloramfenicolo,eritromicina.Il cloramfenicolo e' ora sintetizzato in laboratorio.
RESISTENZA ANTIBIOTICA
si e' notato che un antibiotico prima efficace nei confronti di un certo ceppo batterico,perde poi la sua efficacia.
La RESISTENZA e' un cambiamento genetico piu' o meno stabile che si trasmette alla discendenza. Qual'e' il ruolo degli antibiotici nella resistenza? NON induce la resistenza.....ma seleziona delle cellule della popolazione batterica con cambiamenti genetici tali da dare resistenza. Nella popolazione batterica puo' esserci un mutante che puo' sopravvivere cioe' sia la mutazione che la sua resistenza e' preesistente all'antibiotico.
L'antibiotico ammazza le cellule sensibili.Quali sono le mutazioni che danno resistenza ?
La resistenza puo' essere:
-1) endogena
-2) esogena
-1) cambiamento dell'informazione genetica normale del battere; e' un cambiamento spontaneo del cromasoma batterico.Tale mutazione interferisce con l'attivita' dell'antibiotico.
-2) resistenza acquisita dall'esterno,cioe' acquisizione di nuova informazione genetica da altri microrganismi.E' un cambiamento molto piu' grande alla resistenza endogena.
1) RESISTENZA ENDOGENA
E' una resistenza dovuta a mutazione spontanea ( NON DATA da un antibiotico),quindi e' un cambiamento genetico cioe' di un gene che in qualche modo e' coinvolto nel meccanismo d'azione dell'antibiotico. Abbiamo un batterio in cui muta una tripletta e cosi' cambia un aminoacido della DNA-GIRASI,per cui l'antibiotico non e' piu' in grado di inibire il suo bersaglio perche' questo e' cambiato.Ogni antibiotico ha il proprio bersaglio, se nel gene che codifica quel bersaglio c'e' una mutazione che non ne modifica la funzionalita'ma che muta degli aminoacidi, l'interazione antibiotico/bersaglio non c'e' piu'.
(Streptomicina e eritrocina provocano una mutazione nei geni che recodificano le proteine ribosomiali,allora l'antibiotico non si lega piu' alla proteina perche' non la riconosce.)
SI TRATTA DI UNA MUTAZIONE SPONTANEA .I mutanti batterici resistenti all'antibiotico in una popolazione batterica sono 1/1.000.000 O 1/1.000.000.000. ES.rifampicina :10-6
ES.strestomicina: 10-9
La resistenza endogena puo' essere causa di insuccesso terapeutico di un antibiotico se la frequenza di mutazione spontanea e' alta. Es. se ho 10 alla 9 batteri e uso la rifampicina avro' 1000 batteri mutanti , allora e' meglio avere un antibiotico con frequenza di mutazione piu' bassa.
LA RESISTENZA E' REVERSIBILE IN ASSENZA DI ANTIBIOTICO: il battere mutato di per se' funziona un po' male ed e' una mutazione che ha un vantaggio SOLO in presenza dell 'antibiotico.
Possono infatti avvenire delle contromutazioni, cioe'la mutazione che da' la resistenza e' di per se' scarsamente rilevante da un punto di vista epidemiologico;ha una rilevanza solo nel caso di una terapia.Quindi la resistenza puo' essere causa di un insuccesso in una terapia mirata.
RESISTENZA ANTIBIOTICA CROMOSOMICA
I vari antibiotici possono avere un numero piu' o meno alto di bersagli,la maggior parte degli antibiotici ha un solo bersaglio.(es. rifampicina agisce su RNA-POLINERASI , altri hanno piu' bersagli come i betalattamici su PBP ) PER AVERE LA RESISTENZA DI BATTERI BERSAGLIO DI PENICILLINE CI DOVRANNO ESSERE PIU' MUTAZIONI.
Si dice resistente un ceppo di microrganismo prima sensibile che poi modificando la propria informazione genetica diventa resistente.
SI HANNO DUE TIPI DI RESISTENZA:
1)-endogena cioe' una modificazione spontanea del DNA
2)-esogena cioe' acquisizione di nuova informazione genetica
1) La mutazione alla base della resistenza endogena e' un cambiamento piccolo perche' riguarda un solo gene o anche una sola base ; per avere la resistenza la mutazione deve coinvolgere un gene che codifica per una proteina coinvolta nel meccanismo d'azione dell'antibiotico. La mutazione deve essere tale per cui la proteina che ne deriva sia sempre funzionante ma che non interagisca PIU' con l'antibiotico ( un tale cambiamento deve essere piccolo ) esempio DNA-girasi nei chinoloni,RNA-POLIMERASI nella rifampicina.
Si tratta di mutazioni spontanee,cioe' dipendenti da meccanismi sui blocchi unici intracellulari.
Il migrorganismo mutato e' preesistente al contatto con l'antibiotico ,con che frequenza? 10-6 fino a 10-9
esempio per la rifampicina 10-6 ,per la streptomicin 10-9.
Proprio per questo si scelgono antibiotici con frequenza di mutazione piu' bassa.Le mutazioni di per se' sono svantaggiose perche'portano ad abbassare la funzionalita' del prodotto genico. Le mutazioni che possono avvenire sono limitate, perche' tale prodotto genico deve comunque essere funzionante-
LIVELLI DI RESISTENZA
da un flacone contenente 10alla 9 colonie/ml prelevo o,1ml( CIOE'10alla8 colonie) e pongo su terreno di coltura e metto dentro una quantita' di antibiotico superiore alla MIC ( che ha frequenza di mutazione 10-8). Se ho 10 alla 8 batteri con frequenza 10-8 ,potranno crescere 1 o 2 colonie.Prendo 1 o 2 colonie e ne faccio la MIC, le varie mutazioni che portano alla resistenza portano allo stesso risultato , questi sono detti mutanti "single step", cioe' la resistenza e' dovuta ad 1 singolo evento mutazionale.
Esistono antibiotici per i quali non si ottiene nessun mutante resistente anche dopo aver piastrato 0,1ml (10 alla8 batteri) su terreno con antibiotici.Questo e' il caso dei beta-lattamici; ma con dosi superiori alla MIC SI AVEVANO MUTANTI RESISTENTI.
Si ottengono mutanti a dosi leggermente superiori, ma se venivano innestati i batteri subito ad alte dosi di antibiotici con terreno, non comparivano nessuna colonia resistente.QUINDI SI POSSONO OTTENERE MICRORGANISMI VIA VIA RESISTENTI a dosi crescenti , questi si chiamano mutanti multi-step.
per avere 1 resistenza subito ad alte dosi avrei dovuto innestare 10 alla 16 batteri teoricamente possibile ma non in pratica, questo si ha perche' i beta-lattamici hanno piu' siti di azione.
In terapia e' meglio usare antibiotici multi-step perche' avro' bassa probabilita' di insorgenza di resistenza.LA RESISTENZA E' DOVUTA ALLA SIMULTANEA MUTAZIONE DI TUTTI I SITI D'AZIONE DELL'ANTIBIOTICO, QUINDI NELLA RESISTENZA MULTI-STEP, LA RESISTENZA E'DATA DALLA MUTAZIONE DI TUTTI I SUOI SITI.
RESISTENZA ESOGENA
E' data da acquisizione di informazione genica dall'esterno,informazione che il batterio non ha mai avuto.Si tratta di una drastica mutazione.Questo fatto compromette il meccanismo d'azione degli antibiotici, quindi si avra' una nuova funzione che vanifichera' il meccanismo d'azione degli antibiotici.
Questa resistenza non era spiegabile per mutazione cromosomica: se un microrganismo resistente e' immesso in una popolazione resistente ,tutti i batteri diventavano resistenti.
Alcuni microrganismi oltre al cromosoma principale possono avere elementi genetici aggiuntivi, circolari , ,autonomi,perche' il microrganismo puo' acquisire per informazioni dei plasmidi, operazione tuttavia non indispensabile.
Il batterio ha processi tramite i quali scambia informazioni:
1) trasformazione = scambio di DNA ALLO STATO DI MOLECOLA, derivato perv esempio da un batterio che muore e che scoppia e il suo DNA viene spezzettato e i vari frammenti vengono ricevuti e inglobati,
2) trasduzione= processo dovuto a virus batterici, cioe' microrganismi parassiti cellulari obbligati che sono specifici per le varie specie cellulari; il virus mette il proprio materiale genetico, il virus si riproduce per assemblaggio cioe' si sintetizzano i vari cambiamenti che lo compongono; la testa puo' accumulare informazione non solo virale ma anche di DNA BATTERICO,
3) coniugazione = e' il processo piu' importante.Il trasferimento puo' riguardare DNA CROMOSOMICO OPPURE PLASMIDI
e'dato da pili batterici che sono ponti in cui passa materiale genetico .in particolare di plasmidi.E' il processo piu' efficace per il trasferimento e' un processo che avviene non solo tra batteri della stessa specie ma anche tra BATTERI DI SPECIE DIVERSE.
Le vie di trasferimento di informazione genetica avvengono tramite ;
1) PLASMIDI
2) TRASPOSONI
3) RICOMBINAZIONE GENETICA
La coniugazione puo' riguardare o PLASMIDI o frammenti di DNA CROMOSOMICO . I plasmidi sono capaci di replicazione autonoma( = repliconi) quindi" non devono andare da nessuna parte " .
I frammenti di DNA non sono invece dotati di capacita' di replicazione autonoma e si attaccano al cromosoma per ricombinazione genetica cioe' lo scambio di frammenti di DNA deve avvenire solo tra CEPPI OMOLOGHI, MENTRE I PLASMIDI POSSONO TRASFERIRSI anche tra ceppi NON OMOLOGHI in quanto sono dotati di replicazione autonoma.La cellula donatrice non perde informazione genetica ma cede solo una coppia di propri plasmidi. Questi cambiamenti di informazione genetica servono come adattamento a variazioni ambientali come per esempio in presenza di un antibiotico. NOTA BENE la resistenza e' preesistente all'antibiotico.
Si noto' che con il tempo un batterio poteva diventare resistente a piu' antibiotici e se posto in una popolazione sensibile trasmetteva la resistenza agli altri batteri. Esistono plasmidi in cui vi sono geni che codificano delle proteine resistenti ad un antibiotico, pero' esistono geni che codificano per la resistenza a PIU' ANTIBIOTICI e tale resistenza si puo' trasmettere velocemente ad altri batteri.Questo problema puo' essere risolto con l'antibiogramma.
TRASPOSONE: e'sequenza di DNA NON DOTATA DI REPLICAZIONE AUTONOMA , pero' sanno trasferirsi cioe' "saltare" da un replicone all'altro cioe' da una molecola di DNA ad una altra capace di replicazione autonoma ( CIOE' PLASMIDI E CROMOSOMI).Essi possono anche accettare pezzi di DNA. Un trasposone presenta sequenze terminali dette di mobilizzazione , che comprendono geni qualsiasi.Il trasferimento avviene solo se le sequenze terminali hanno una specifica sequenza.Il trasposone puo' essere replicato e trasferirsi ad un altro replicone oppure staccarsi dal replicone e dare il ricucimento delle sequenze alle estremita'.
I TRASPOSONI POSSONO ESSERE PONTI TRA REPLICONI DIVERSI. Questi possono permettere il trasferimento di geni per la resistenza da un replicone all'altro.
Come fa quesTo gene acquisito a portare la resistenza?
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MECCANISMI MOLECOLARI DELLA RESISTENZA ANTIBIOTICA
La resistenza puo' manifestarsi come:
-alterazione del bersaglio su cui agisce l'antibiotico che non riconosce piu' il suo bersaglio esempio la RNA-polmerasi per la rifampicina ( vedi resistenza endogena).
-produzione di enzimi inattivanti cioe' inattivano l'antibiotico. Il batterio deve acquisire un gene ( resistenza esogena) che possa produrre un enzima nuovo da un gene mutato.La resistenza ai beta-lattamici e' sempre di questo tipo:porta a rottura dell'anello beta-lattamico con beta-lattamasi,
-efflusso cellulare attivo:" buttare fuori" cioe' l'acquisizione di un complesso sistema di trasporto di membrana che espelle non un singolo antibiotico ma piu' antibiotici, si tratta di resistenza esogena.
Ogni antibiotico presenta piu' meccanismi di resistenza:
1) ALTERAZIONE DEL BERSAGLIO :cioe' ridotta affinita' dell'antibiotico al bersaglio.Il bersaglio e' mutato in modo che l'antibiotico non si attacca piu'.
E' un tipo di resistenza endogena,infatti consiste in una modifica mutazionale del bersaglio ,cambiamento della sequenza aminoacidica (accade per la rifampicina e i chinoloni) esempio cambiamento della subunita'beta per la RNA-polimerasi per la rifampicina in diversi mutanti resistenti. Cosa cambia nella subunita' beta? La mutazione avviene spontanea tra l'aminoacido 505 e 534 in Escherichia coli, o tra l'aminoacido 399 e 428 per MYCOBACTERIUM tubercolosis ( esempio in Escherichia coli in posizione 512 la serina e' sostituita da Phe o da Pro).Dunque avviene spontaneamente un cambiamento endogeno in aminoacidi.
I beta-lattamici si legano a PBP ma alcune penicilline si legano piu' fortemente a specifiche PBP: esempio la aminocillina si lega a PBP2.E' preferibile usare dei beta-lattamiciche hanno affinita' per piu'PBP.
Un altro esempio e' dato da ribosomi 70S ( esempio neomicina,eritromicina) questi antibiotici si legano a specifici punti delle 2 subunita'.
NOTA BENE : I LEGAMI antibiotico/ bersaglio sono legami non covalenti.Questi casi sono sempre esempi di resistenza ENDOGENA.
2) IPERPRODUZIONE DEL BERSAGLIO: si verifica una sovraproduzione della molecola bersaglio.
La cellula regola la sintesi delle proteine.Esempio: se avviene una mutazione NEL PROMOTORE, per cui la RNA-polimerasi ha maggiore affinita'per esso,si verifica una iperproduzione della proteina codificata da quel gene quindi servono piu' molecole per inibire tutte le molecole bersaglio .E' un esempio di resistenza ENDOGENA.
3)SOSTITUZIONE DEL BERSAGLIO:i chinoloni hanno come bersaglio la DNA-GIRASI.La cellula batterica oltre alla DNA-girasi-bersaglio sintetizza anche una altra DNA-GIRASI pero' deve avere un nuovo gene ,acquisito per resistenza ESOGENA.
Esempio: meccanismo di resistenza agli antibiotici glicopeptidici come la VANCOMICINA da parte degli enterococchi:
i glicopeptidici sono ad alto peso molecolare( vedi definizione generale degli antibiotici).La vancomicina si attacca alla parte terminale della catena aminoacidica del peptidoglicano,bloccandola e impedendo l'azione degli enzimi per la sintesi del peptidoglicano. Nel meccanismo intervienel'acquisizione di 9 nuovi geni da parte di un trasposone per cui ci sono 9 nuove proteine, la cellula cambia la struttura finale del suo peptidoglicano a livello delle ultime 2 D-Ala ( la vancomicina non si lega piu'); una delle proteine sintetizzata dal triposone (detta VAN S) si colloca a livello della parete, si lega alla vancomicina e fa partire un segnale intracellulare che fa sintetizzare le proteine codificate dal nuovo trasposone. Una di queste proteine impedisce la formazione di D-ala (VAN X),VAN H converte il piruvato in D-lattato e VAN A lega una D-ala al D-lattato. Alla fine si sintetizza una catena aminoacidica che non ha piu' due D-ala finali ma una D-ala e un D-lattato cosi' la vancomicina non si lega piu'perche' non si crea un legame H TRA LA CATENA AMINOACIDICA E LA VANCOMICINA.
Infatti si ha la sostituzione di un gruppo -NH con un O- nella catena aminoacidica per la sostituzione di D-ala con D-lattato. Questo e' un esempio di resistenza ESOGENA.Il trasposone presenta una parte alle estremita'che deve essere costante ma la parte costante puo' essere di qualsiasi natura ma da dove viene ? Probabilmente da un lactobacillo che gia' presenta particolarita' nella propria parete e che casualmente ha trasferito il trasposone ad un enterococco.
PRODUZIONE DI ENZIMI INATTIVANTI
consiste nell'acquisizione di geni che codificano enzimi inattivanti per resistenza ESOGENA,
Diversi sono gli antibiotici che hanno tale meccanismo di resistenza:
beta-lattamasi = distruggono l'anello betalattamico delle penicilline e delle cefalosporine inattivandole. Ce ne sono di tanti tipi: i geni per le betalattamasi infatti subiscono una mutazione spontanea che porta alla nascita di una nuova beta-lattamasi.
cat = aciltransferasi:aggiungere un gruppo acetilico al cloramfenicolo, rendendolo inattivo.
Da dove arriva la porzione del trasposone che codifica per l'enzima inattivante? Gli antibiotici sono metaboliti derivati dal metabolismo secondario di alcuni microrganismi.Si e' osservato che in tutti i microrganismi che producono antibiotici, sono presenti i geni che producono enzimi che sanno distruggere tali molecole.Si tratta di geni che la cellula resistente ha gia'acquisito dall'esterno,gia' presente in natura.
EFFLUSSO CELLULARE ATTIVO
si tratta di PERMEASI nella membrana che tramite consumo di ATP, riconoscono l'antibiotico e lo estrudono dalla cellula.
Nei GRAM- c'e' un meccanismo piu' complesso: esempio la tetraciclina e' un inibitore della sintesi proteica, la tetraciclina si lega alla subunita' 50S. Questa selettivita' non e' dovuta a diversita' strutturale tra i ribosomi ma a diversita'di permeabilizzazione in quanto e' elimiměnata tramite pompa di efflusso.
E' una resistenza di tipo ESOGENO.
Esistono molti sistemi che derivano da trasposoni su localizzazione plasmidica, altri da trasposoni su localizzazione cromosomica.
Qualsiasi microrganismo che produca antibiotico ha un insieme di geni che costituiscono una via metabolica per proteggersi dall'antibiotico stesso, tali geni possono essere anche acquisiti da altri microrganismi.
Sappiamo che lo spettro d'azione e' l'insieme dei microrganismi verso cui l'antibiotico e' attivo,ma perche' verso certi microrganismi l'antibiotico e' inattivo? Perche' i microrganismi (esempio la Pseudomonas aeruginosa) hanno acquisito dei sistemi di efflusso. Quindi i sistemi di efflusso derivano da microrganismi produttori di antibiotici e da microrganismi intrensicamente resistenti ( cioe' di una resistenza esogena acquisita tanto tempo fa e che attivano solo con l'antibiotico). Un microrganismo puo' avere uno stesso sistema di efflusso capace di funzionare su antibiotici anche chimicamente diversi,questo e' esempio di resistenza multipla. Esempio la Escherichia coli ha pompe di efflusso per la tetraciclina,cloramfenicolo, beta-lattamici,rifampicina.
Le infezioni NOSOCOMIALI (PRESE IN OSPEDALE) sono le piu' gravi perche' in ospedale si selezionano i microrganismi resistenti.Col passare del tempo gli antibiotici invecchiano perche' col tempo sono note specie resistenti per la formazione di sistemi di efflusso che in alcuni casi si e' tentato di bloccare per esempio con tetraciclina modificata.
Per ogni antibiotico esistono piu' strategie di resistenza , per esempio per i beta-lattamici si ha resistenza in base a permeabilita', affinita', inattivazione (= sopratutto), ridotta attivita'delle funzioni secondarie.
Nella battaglia antibiotico/microrganismo vinceranno sempre i microrganismi. L'antibiotico implica un meccanismo d'azione, implica un bersaglio che puo' cambiare.
NEI DISINFETTANTI NON ESISTE UN MECCANISMO D'AZIONE.
STRATEGIE DI CONTRASTO ALLA RESISTENZA ANTIBIOTICA
consistono nello sviluppare normative razionali per un uso razionale degli antibiotici dal momento che piu' si usano gli antibiotici piu' si selezionano microrganismi resistenti.
ATTENZIONE al rispetto assoluto della posologia
Si sono studiate associazioni di antibiotici noti: esempio chemioterapici che abbassano la biosintesi di acido folico(sulfamidici e trimetoprim) sono associati nel BACTRIM:
se si usano antibiotici con lo stesso meccanismo d'azione, pero' su punti diversi, si riducono ulteriormente le frequenze di resistenza.
E' necessario contrastare l'insorgenza e la diffusione della resistenza e regolamentare l'utilizzazione di antibiotici anche sugli animali. In tutti gli allevamenti zootecnici si e' osservato che se si aggiungevano piccole dosi di antibiotici nel mangime ,si aveva una resa in carne e altro del 10% in piu'.Tali antibiotici erano diversi da quelli per uso umano anche se avevano lo STESSO MECCANISMO D'AZIONE.In questo ambiente si e' usata una quantita' massiccia di antibiotici e cosi' sono nate molte resistenze.
Tutto cio' porta a studiare ,a livelli molecolare ,i meccanismi di resistenza :
- a riprendere la ricerca di nuovi antibiotici e di derivati semisintetici di antibiotici noti ,che risultano attivi sui ceppi resistenti. Bisogna rivalutare antibiotici gia' noti ma non sviluppati, negli anni 60 sono stati brevettati molti antibiotici ma che poi non sono stati messi in commercio.
Tra la scoperta e la messa in commercio possono passare oltre 10 anni. I ceppi di penicillina sapevano produrre
1mg/l di antibiotico quindi bisogna per forza aumentare la produzione di antibiotico.Gli antibiotici hanno un costo proporzionale a quanto se ne riesce a produrre.
-Bisogna ricercare molecole attive sui nuovi bersagli molecolari es : lipide A dei lipopolisaccaridi nei GRAM-.
-Bisogna ricercare molecole attive sui meccanismi di resistenza.
-Bisogna ricercare molecole attive sui meccanismi di patogenesi ( adesine e invasine).
Antibiotici
I batteri sono organismi dell'ordine di 1-10 micron.La pelle separa il mondo esterno dai tessuti interni che devono essere sterili.I microrganismi entrati nell'organismo provocano infezioni es.clostridium tetani,clostridium botulinum,clostridium difficile, staphylococcus aureus, ecc.
la superficie del nostro corpo e'rivestita da batteri che costituiscono la flora batterica.Quindi il battere che supera le barriere fisiche e quelle immunitarie puo' provocare infezioni.
Le infezioni possono insorgere in vari organie per curarle si usano gli antibiotici.Gli antibiotici sono farmaci che servono a curare processi infettivi provocati da batteri che si trovano in luoghi in cui non si devono trovare.Gli antibiotici sono metaboliti secondari di basso peso molecolare prodotti da batteri e funghi capaci di inibire a basse concentrazioni(nell'ordine di micron/ml) la crescita di altri microrganismi.
Alcuni microrganismi nelle loro vie anaboliche possono sintetizzare quella molocola che il microrganismo non ha nell'ovvia funzione (= metabolita secondario).
La posologia dovra' portare nei termini corporei opportune concentrazioni che percio' devono essere piccole e in grado di inibire la crescita di microrganismi.I funghi e i batteri che creano antibiotici sono alcuni.
Fleming coltivo'una piastra di Petri che si inquino' di una muffa ed intorno ad essa le colo nie batteriche non crebbero.Si tratta di penicillum,un fungo che e' in grado di provocare la inibizione del batterio staphylococcus aureus,Tale sostanza era la penicillina.Si e' poi visto che la penicillina era in grado di curare infezioni mortali.
Porto' una rivoluzione importante nella cura dei processi infettivi.
Pero' la penicillina come gli altri antibiotici non era in grado di uccidere tutti i batteri ma solo i gram+ e alcuni gram-.Quindi nacque la ricerca e lo sviluppo di nuovi antibiotici per ricercare altri antibiotici in grado di uccidere : :griseofulvina,cloramfenicolo,streptomicina,neomicina,rifampicina,gentamicina,vancomicina,eritromicina.Dagli anni30 agli 80 sono stati scoperti tanti antibiotici.
1)quindi gli antibiotici sono molecole naturali
2)un antibiotico naturale ha limitazioni d'uso: es. la penicillina non faceva nulla per os perche' era intaccata dal succo gastrico ed era attva solo iniettabile.Il compito dei chimici farmaceutici era quello di migliorare le caratteristiche farmaceutiche della penicillina in modo da renderla resistente anche per os.Nacquero cosi'gli antibiotici SEMISINTETICI cioe' derivati da molecole naturali ma modificate.
3)le molecole sono piccole.Allora e' parso piu'conveniente per alcuni antibiotici sintetizzare la molecola in laboratorio copiandola dal modello naturale.
4)ci sono poi dei chemioterapici antimicrobici,( come es. i sulfamidici),sintetizzati in laboratorio non esistenti in natura,es.sulfamidici,chinoloni,trimetoprim.
Quindi gli ANTIBIOTICI possono essere:
1)naturali
2)semisintetici
3)sintetici
4)chemioterapici antimicrobici.
Gli antibiotici piu'USATI sono di 160 tipi:
70 :cefalosporine,derivate da cefalosporina C
50 :penicilline, derivate da penicillina G
12 : tetracicline,la via semisintetica e' molto importante perche'permette di creare antibiotici attivi modificando quelli non piu' attivi
9 : macrolidi
8 :aminoglicosidi
3 :carbapemi
BERSAGLI degli antibiotici:
antibatterici attivi contro i batteri
antifungini attivi contro i funghi, ma inattivi contro i batteri
antiprotozoari attivi contro i protozoi
antivirali attivi contro i virus
poi:
antitumorali
immunosoppressivi
Infatti alcuni microrganismi producono molecole naturali che hanno una diversa attivita'farmacologica e che sono attivi sui tumori( es doxamicina) o contro il sistema immunitario nei rigetti (es ciclosporine).
Quindi i microrganismi sono una grande sorgente di molecole farmacologiche.
CONCENTRAZIONE MINIMA INIBENTE (MIC)
MIC= minima concentrazione a cui un antibiotico e' in grado di inibire un microrganismo.E' importante per stabilire la POSOLOGIA cioe' quanto devo somministrare per ottenere una certa concentrazione in un tessuto ,maggiore della MIC.
Il rispetto della posologia e' fondamentale.
DETERMINAZIONE DELLA MIC
Come si determina? avro' un antibiotico e un microrganismo,si prendono delle provette contenenti terreno maximo liquido poi aggiungo il microrganismo e quantita' crescenti di antibiotico.Pongo le provette in termostato,osservo la crescita batterica:se il micorganismo non e' inibito il terreno si intorbidisce.Viceversa se il terreno non e' torbido vuol dire che la crescita cellulare e'distrutta.La MIC sara' la concentrazione di antibiotico corrispondente a quella provetta campione che contiene il piu' basso contenuto di antibiotico. Quindi dovro' somministrare una quantita' di antibiotico che permette di raggiungere una concentrazione maggiore o uguale alla MIC.OvViamente bisogna tenere conto delle caratteristiche chimico fisiche e farmacocinetiche dei farmaci.
A QUESTO PUNTO MI DOMANDO:
L'antibiotico ha inibito la moltiplicazione batterica (batteriostatico)o ha ucciso i microrganismi(battericida)?
Vado a prelevare dalle provette limpide 0,1ml e lo pongo in un terreno di coltura:se ho crescita vuole dire che l'antibiotico e' batteriostatico se viceversa non c'e' crescita vuole dire che l'antibiotico e'battericida.
Attivita'battericida:
betalattamici (cefalosporine, penicilline)
rifampicina
Attivita'batteriostatica:
cloramfenicolo
sulfamidici
Gli antibiotici vengono saggiati su vari microorganismi,ognuno e' indicato con una sigla, che indica la collezione
es.ATCC,american type colture collection,per avere risultati ripetibili.I saggi biochimici per identificare i microrganismi danno risultati diversi percio' si usano ceppi di collezione, che sono caratterizzati da batteri tutti eguali.
Quando vado a usare un antibiotico per una infezione, posso essere sicuro che la MIC indicata inibisce qualsiai tipo di battere con quel nome?NO ,perche' la MIC di un antibiotico vale solo per quel ceppo preso in esame:quindi ogni antibiotico va testato su piu' ceppi diversi ma della specie batterica presa in esame.Le infezioni sono fatte da microrganismi "selvatici".Ogni opedale ha un laboratorio che analizza microrganismi realmente implicati nelle patologie.La dose realmente efficace su un microrganismo e' detta " MIC90 ".Gli antibiotici vengono testati su
DIVERSI CEPPI di una specie e ottengo varie MIC. DEFINIZIONE di " MIC90": e' la concentrazione necessaria per inibire almeno il90% dei ceppi di una stessa specie.La MIC90 garantisce quindi il 90% delle guarigioni.
SPETTRO DI AZIONE DI UN ANTIBIOTICO
E'l'insieme dei microrganimi che possono essere trattati con quel antibiotico.Gli antibiotici sono molto selettivi, esempio FLOBACIN (chinolone) ha principio attivo la floxacina un antibatterico attivo contro i gram+ e gram- e la MIC90 e' testata su diversi ceppi di una stessa specie.
Le infezioni nosocomiali sono quelle prese in ospedale.Piu' alto e' il valore della " MIC90" piu' efficace la terapia contro quel microbo e minori sono gli effetti collaterari.Bisogna inoltre essere sicuri che una certa patologia sia sostenuta da quel microrganismo = es.FLOBACIN e' indicato nelle vie respiratorie, e per ogni patologia e'indicata anche la %ale di guarigione.
La posologia dell'antibiotico e'stabilita in modo da ottenere una concentrazione uguale o maggiore della MIC90 in modo da ottenere una buona % di successi perche' l'antibiotico e' gia' stato testato su diversi ceppi della stessa specie.
Gli antibiotici beta-lattamici(cefalosporine, penicilline) sono attivi a livello della SINTESI DEI PEPTIDOGLICANI
e non sono attivi sui micoplasmi(batteri senza parete cellulare).
L'antibiotico non e' attivo verso quei microrganismi non inclusi nello spettro.
In base a cio' gli antibiotici vengono divisi:
ad AMPIO spettro, agiscono su molti microrganismi es. tetracicline
a STRETTO spettro , agisono su pochi microrganismi specifici es.tobramicina.
Gli antibiotici ad ampio spettro si danno per il pronto intervento ma spesso questi hanno una maggiore tossicita'perche' uccidono anche la flora batterica (es. intestinale).La flora quindi si squilibra provocando infezioni particolari :nei bambini se si abusa in antibiotici permane il Clostridium difficile che puo' provocare anche la morte.
RESISTENZA ANTIBIOTICA
alcuni microeganismi nel tempo possono diventare resistenti all'antibiotico a cui erano sensibili.Un microrganismo resistente e' geneticamente modificato perche'l'antibiotico ha permesso la sopravvivenza di quel ceppo,prima sensibile.Poi si e' andati verso ad un aumento di concentrazione.Oggi la penicillina non e' piu' attiva verso lo Stafilococcus aureus perche' si e' diffuso un ceppo resistente. E' naturalmente essenziale scegliere l'antibiotico giusto.
ANTIBIOGRAMMA
E' lo spettro d'azione cioe' l'insieme dei microrganismi sensibili ad un antibiotico .L'antibiogramma cambia con il tempo :cioe' ceppi appartenenti a una specie sensibile ad un determinato antibiotico possono poi manifestare resistenza.Si possono incontrare ceppi che diventono resistenti nel tempo,percio' ci sono consequenze :
-spettro d'azione e' variabile (aumentano i ceppi resistenti)
-l'associazione antibiotico/microrganismo non e' sempre valida cambia qualche cosa nel microrganismo, cambia in senso GENETICO ma non perche'e' venuto a contatto con l'antibiotico,questo giustifica il fatto perche' la tubercolosi sta ritornando.
Per risolvere il problema dell'antibiotico giusto si ricorre all'ANTIBIOGRAMMA;nei confronti del microrganismo responsabile del processo infettivo si saggia qual'e' l'antibiotico attivo; si fa prelievo del microrganismo dalle feci o dalle urine e lo si isola in un terreno di coltura massimo : noi non sappiamo quale e' il microrganismo,si prende una singola colonia e la si pone in un terreno di coltura e si vede il microrganismo crescere.Si prende un timbro costituito da tanti cilindretti con dentro dei dischetti impregnati di antibiotici reputati piu'efficaci ....
poi faccio cadere i dischetti sulla piatra contenente il microrganismo.L'antibiotico diffonde nell'agar e man mano inibisce la crescita del microrganismo intorno ai dischetti formando degli aloni di inibizione; il risultato e' l'antibiogramma ma insieme si saggia anche l'efficacia degli antibiotici,Cosi' si sceglie il giusto antibiotico in base al diametro dell'alone di inibizione e delle caratteristiche del paziente.Limite :
OCCORRE TROPPO TEMPO,circa due giorni,e non si puo' intervenire per le emergenze;si agisce per esperienza e si puo' utilizzare questo metodo per confermare l'effettiva efficacia dell'antibiotico che ho scelto.
Di fronte a un quadro clinico e' difficile scegliere un antibiotico.Come si fa a sceglierlo?
-per le emergenze si fa una terapia EMPIRICA cioe' mi posso basare solo sull'esperienza clinica usando l'antibiotico che ha la maggiore probabilita'di attivita'sul microrganismo patogeno ipotizzato come responsabile; posso utilizzare un antibiotico ad AMPIO SPETTRO che ha maggiore probabilita' di successo.L' antibiogramma mi permette di sapere se l'antibiotico usato e' veramente efficace.
-per la terapia non urgente,si fa la TERAPIA MIRATA E DEFINITIVA.Si fal'isolamento del microrganismo e l'antibiogramma,si usa l'antibiotico a spettro stretto.
L'ANTIBIOTICO dopo un po' di tempo non funziona piu'perche' diventa resistente, subisce un cambiamento genetico.La conoscenza di questa resistenza indirizza la ricerca di nuovi antibiotici,particolarmente dei derivati semisintetici.
MECCANISMO D'AZIONE DEI DISINFETTANTI E DEGLI ANTIBIOTICI
DISINFETTANTI,hanno spettro a 360°,
non sono selettivi, possono essere nocivi anche per le cellule dell'organismo.
ANTIBIOTICI,ognuno ha il suo spettro,
sono selettivi,cioe' capaci di agire ,colpire con azio battericida e batteriostatica solo sui microrganismi SENSIBILI interferendo il meno possibile con le cellule dell'organismo.Per esempio i beta-lattamicisono i piu' importanti a livello chimico(= penicilline e cefalosporine)sono selettivi perche' colpiscono la parete batterica cioe' inibiscono la biosintesi della parete cellulare,struttura essenziale per la vita dei batteri.
Tutti i bersagli degli antibiotici devono essere funzioni essenziali dei microrganismi.I beta-lattamici sono selettivi perche' solo i batteri hanno la PARETE CELLULARE.
Una volta compreso il meccanismo d'azione si puo' comprendere il proprio meccanismo di azione proprio a differenza dei disinfettanti.
Gli antibiotici possono inibire una importante funzione cellulare dei batteri:
-biosintesi della parete cellulare
-sintesi del DNA batterico
-sintesi DELL'RNA batterico
-sintesi proteica (e'il piu'complesso processo biochimico cellulare)
-vie metaboliche essenziali.
In caso di resistenza si puo' trovare una strategia alternativa.
1)INIBITORI DELLA BIOSINTESI del PEPTIDOGLICANO (beta-lattamici)
Il peptidoglicano e' un componente essenziale della parete cellulare presente in tutti i batteri tranne i micoplasmi.E' formato da una parte peptidica e una zuccherina. E' PRESENTE SIA NEI GRAM+ ( PIU' CONSISTENTE) SIA NEI GRAM- (PIU' SOTTILE). E' costituito da tanti fili che devono essere uniti per dare rigidita'.
I filamenti sono zuccherini(n-acetilglucosamina e n-acetilmuramico).
Al NAM e' legata una catena amminoacidica che unisce i vari filamenti attraverso legami diretti nei GRA-, oppure con interposizione di" 5 Gly-" nei GRAM+ tra le catene amminoacidiche.Se non ci sono tali legami la parete non e' piu' rigida.Nei punti in cui si forma il legame con le "5 Gly" c'e' una D-alanina
.La rigidita'e' data dal legame che avviene tra catene aminoacidiche,legame che puo' essere:
-diretto nei GRA-
-indiretto con l'interposizione di 5Gly nei GRAM+ . La D-alanina che lega 5 Gly e' legata ad una altra D-alanina,l'enzima TRANSPEPTIDASI stacca il legame tra le D-alanine (l'ultima D-alanina) per creare il legame tra D-alanina rimasta e la Gly-.
A livello del citoplasma si formano i precursori: da un lato c'e' una via metabolica che porta a NAG,l'altra produce NAM (cui e' legata la catena degli aminoacidi). C'e' una proteina di trasporto che trasporta il precursore di NAM e durante il trasporto NAM si lega a NAG, il nuovo mattone si attacca a quelli gia' presenti e permette l'accrescimento della parete.
Non solo i beta-lattamici ma anche la cicloserina, bacitracina,vancomicina intervengono a livello della biosintesi:
la vancomicina impedisce l'inserimento di nuovi mattoni,
la bacitracina inibisce il trasporto,
la cicloserina impedisce la sintesi di D-alanina (uguale non c'e' piu' il precursore) impedendo l'attivita' di racemasi(L-alanina che diventa D-alanina):
D-cicloserina si attacca al sito attivo dell'enzima con legame debole perche' ha una struttura simile alla D-alanina.
GLI ANTIBIOTICI SI LEGANO A UNO SPECIFICO BERSAGLIO,impedendone la funzionalita'.
I beta-lattamici hanno un anello betalattamico, questa struttura non si puo' modificare altrimenti non funziona piu'.
Posso interferire chimicamente solo sulla catena R ,nelle penicilline esiste una catena R,nelle cefalosporine ci sono 2 catene R,PERCIO' HO PIU' POSSIBILITA' DI INTERVENIRE perche'hanno piu' gruppi R, vedi esempio:
La penicillina G era solo iniettabile ,perche' non e' gastroresistente.
I derivati semisintetici con che logica vengono ricercati? si cerca di migliorare sia lo spettro d'azione sia
la farmacocinetica.
esempio : la penicillina G non era somministrabile per via orale,instabile alle betalattamasi dello Staphylococcus aureus e non era attiva sui GRAM-.Il primo arrivato l'AMPICILLINA ERA SOMMINISTRABILE PER VIA ORALE ED ERA ATTIVA ANCHE SUI GRAM-,USATISSIMA PER LA TERAPIA EMPIRICA.
i nomi iniziano per "cefo".
Gli antibiotici inibitori servono a bloccare la sintesi del setto ,provocano un rigonfiamento al centro. ATTENZIONE
SONO SEMPRE BATTERICIDI.Il rigonfiamento dovuto al trattamento con i beta-lattamici e' dovuto al fatto che i batteri
si riproducono per scissione e perdono la struttura rigida del peptidoglicano; se la parete perde la
rigidita',l'H2O dall'esterno non e' piu' trattenuta ,entra nella cellula per osmosi cosi' la cellula scoppia e
muore.
L'enzima transpepidasi e' responsabile della formazione del legame covalente tra le 2 catene laterali(tra la D-alanina e la Gly).Le penicilline possono inibire questo enzima: da un punto di vista stereochimico la penicillina e' molto simile al dimero D-alanil-D-alanina quindi la penicillina si puo' attaccare al sito attivo della transpeptidasi che non funziona piu'.La transpeptidasi ha 2 siti attivi che riconosce i 2 peptidoglicani da unire.
I beta-lattamici diminuiscono la biosintesi del peptidoglicano ;il piu'probanile bersaglio e' la transpeptidasi.E' stata usata penicillina radioattiva,poi si purifica la proteina di membrana tramite SDS (= elettroforesi su gel agarosio,se e' vero che il bersaglio della penicillina e' la transpeptidasi(che ce ne' solo una),la penicillina dovrebbe legarsi ad una sola banda(creata dalle proteine)cioe' quella della transpeptidasi;si fa una lastra fotografica:si vede che la penicillina si e' legata a 5-6 bande(=penicillin binding proteins) cioe' si lega a piu' proteine PBP perche' esistono piu'enzimi che intervengono nella sintesi della parete:endopeptidasi che rompono i legami e permettono la creazione di spazio per aggiungere nuovo peptidoglicano.
Esiste un enzima poi che toglie la D-alanina finale ; QUINDI CI SONO PIU'ENZIMI CHE INTERVENGONO NELLA BIOSINTESI del peptidoglicano e che riconoscono il dimero D-alanil-D-alanina.
Penicilline e cefalosporine hanno lo stesso meccanismo d'azione.
SELETTIVITA' DEI BETA-LATTAMICI :inibiscono la biosintesi della parete cellulare al contrario dei disinfettanti che non hanno attivita' specifica,ricorda che le cellule umane non hanno parete cellulare.
CARATTERISTICHE BIOLOGICHE COMUNE AGLI INIBITORI DELLA BIOSINTESI DEL PEPTIDOGLICANO
sono attivi solo sulle cellule in fase di crescita,cioe' su quelle che stanno sintetizzandola parete.
La terapia deve essere intermittente, cioe' a certi intervalli di tempo .Se ho una concentrazione inferiore alla MIC mentre le cellule batteriche si stanno dividendo non tutte vengono uccise, ma le cellule che sopravvivono vengono uccise nel prossimo picco. Da ricordare che i beta-lattamici sono inattivi sui batteri privi di parete cellulare come i micoplasmi e sono generalmente BATTERICIDI. Sono altamente selettivi,ma hanno effetti collaterali tra cui il piu' importante e' l'allergia e sapere se si e' allergici e' importante per un eventuale trattamento ospedaliero.
ANTIBIOTICI INIBITORI DELLA SINTESI MACROMOLECOLARE DI DNA E RNA
esempio DAUNOMICINA,ETIONIO BROMURO,FECOMICINA ?
non sono selettivi perche' intervengono anche sul DNA e RNA delle cellule umane.....percio' sono usati come antitumorali dal momento che si legano a cellule che si dividono rapidamente.
Pero' sono essi stessi cancerogeni ma il rapporto rischio / beneficio e' basso.
Esistono antibiotici che si legano a enzimi responsabili della sintesi di DNA batterico e sono chemioterapici antimicrobici: i chinoloni esempio acido nalidixico usato per le infezioni alle vie urinarie, da cui sono stati sintetizzati numerosi derivati come acido pipemidico , acido oxocinico, norfloxacin,gloxacin ,ciprofloxacin .enoxacin.....tutti i derivati chemioterapici terminano in oxacin.Bloccano la sintesi del DNA BLOCCANDO LA REPLICAZIONE cioe' bloccano la DNA-girasi umana che e' diversa da quella batterica (differente e' affinita' per il bersaglio che e' uno dei meccanismi di selettivita' piu' diffusi; esempio ciproxin cioe' ciprofloxacin abbassa DNA- GIRASI BATTERICA.
RIFAMPICINA
inibisce l'enzima che sintetizza m-RNA ( RNA polimerasi), legandosi alla sua subunita' beta ,quindi la sintesi proteica crolla. E' un meccanismo di selettivita': la RNA-polimerasi umana e' un po' diversa. ( esempio rifocin ).
Effetti collaterali: induttore del citocromo P 450, interferendo con l'eliminazione di altri farmaci ( es contraccettivi orali).
ANTIBIOTICI INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICA
Si attaccano ai ribosomi (70S) e' meccanismo di selettivita' perche' i ribosomi umani sono piu' grandi (80s).
Ci sono 2 casi
-1 ) si legano alla sub 30S es.streptomicina,tetraciclina,gentamicina ( struttura aminoglicosidica).
-2 ) si legano alla sub 50S es. cloramfenicolo,eritromicina.Il cloramfenicolo e' ora sintetizzato in laboratorio.
RESISTENZA ANTIBIOTICA
si e' notato che un antibiotico prima efficace nei confronti di un certo ceppo batterico,perde poi la sua efficacia.
La RESISTENZA e' un cambiamento genetico piu' o meno stabile che si trasmette alla discendenza. Qual'e' il ruolo degli antibiotici nella resistenza? NON induce la resistenza.....ma seleziona delle cellule della popolazione batterica con cambiamenti genetici tali da dare resistenza. Nella popolazione batterica puo' esserci un mutante che puo' sopravvivere cioe' sia la mutazione che la sua resistenza e' preesistente all'antibiotico.
L'antibiotico ammazza le cellule sensibili.Quali sono le mutazioni che danno resistenza ?
La resistenza puo' essere:
-1) endogena
-2) esogena
-1) cambiamento dell'informazione genetica normale del battere; e' un cambiamento spontaneo del cromasoma batterico.Tale mutazione interferisce con l'attivita' dell'antibiotico.
-2) resistenza acquisita dall'esterno,cioe' acquisizione di nuova informazione genetica da altri microrganismi.E' un cambiamento molto piu' grande alla resistenza endogena.
1) RESISTENZA ENDOGENA
E' una resistenza dovuta a mutazione spontanea ( NON DATA da un antibiotico),quindi e' un cambiamento genetico cioe' di un gene che in qualche modo e' coinvolto nel meccanismo d'azione dell'antibiotico. Abbiamo un batterio in cui muta una tripletta e cosi' cambia un aminoacido della DNA-GIRASI,per cui l'antibiotico non e' piu' in grado di inibire il suo bersaglio perche' questo e' cambiato.Ogni antibiotico ha il proprio bersaglio, se nel gene che codifica quel bersaglio c'e' una mutazione che non ne modifica la funzionalita'ma che muta degli aminoacidi, l'interazione antibiotico/bersaglio non c'e' piu'.
(Streptomicina e eritrocina provocano una mutazione nei geni che recodificano le proteine ribosomiali,allora l'antibiotico non si lega piu' alla proteina perche' non la riconosce.)
SI TRATTA DI UNA MUTAZIONE SPONTANEA .I mutanti batterici resistenti all'antibiotico in una popolazione batterica sono 1/1.000.000 O 1/1.000.000.000. ES.rifampicina :10-6
ES.strestomicina: 10-9
La resistenza endogena puo' essere causa di insuccesso terapeutico di un antibiotico se la frequenza di mutazione spontanea e' alta. Es. se ho 10 alla 9 batteri e uso la rifampicina avro' 1000 batteri mutanti , allora e' meglio avere un antibiotico con frequenza di mutazione piu' bassa.
LA RESISTENZA E' REVERSIBILE IN ASSENZA DI ANTIBIOTICO: il battere mutato di per se' funziona un po' male ed e' una mutazione che ha un vantaggio SOLO in presenza dell 'antibiotico.
Possono infatti avvenire delle contromutazioni, cioe'la mutazione che da' la resistenza e' di per se' scarsamente rilevante da un punto di vista epidemiologico;ha una rilevanza solo nel caso di una terapia.Quindi la resistenza puo' essere causa di un insuccesso in una terapia mirata.
RESISTENZA ANTIBIOTICA CROMOSOMICA
I vari antibiotici possono avere un numero piu' o meno alto di bersagli,la maggior parte degli antibiotici ha un solo bersaglio.(es. rifampicina agisce su RNA-POLINERASI , altri hanno piu' bersagli come i betalattamici su PBP ) PER AVERE LA RESISTENZA DI BATTERI BERSAGLIO DI PENICILLINE CI DOVRANNO ESSERE PIU' MUTAZIONI.
Si dice resistente un ceppo di microrganismo prima sensibile che poi modificando la propria informazione genetica diventa resistente.
SI HANNO DUE TIPI DI RESISTENZA:
1)-endogena cioe' una modificazione spontanea del DNA
2)-esogena cioe' acquisizione di nuova informazione genetica
1) La mutazione alla base della resistenza endogena e' un cambiamento piccolo perche' riguarda un solo gene o anche una sola base ; per avere la resistenza la mutazione deve coinvolgere un gene che codifica per una proteina coinvolta nel meccanismo d'azione dell'antibiotico. La mutazione deve essere tale per cui la proteina che ne deriva sia sempre funzionante ma che non interagisca PIU' con l'antibiotico ( un tale cambiamento deve essere piccolo ) esempio DNA-girasi nei chinoloni,RNA-POLIMERASI nella rifampicina.
Si tratta di mutazioni spontanee,cioe' dipendenti da meccanismi sui blocchi unici intracellulari.
Il migrorganismo mutato e' preesistente al contatto con l'antibiotico ,con che frequenza? 10-6 fino a 10-9
esempio per la rifampicina 10-6 ,per la streptomicin 10-9.
Proprio per questo si scelgono antibiotici con frequenza di mutazione piu' bassa.Le mutazioni di per se' sono svantaggiose perche'portano ad abbassare la funzionalita' del prodotto genico. Le mutazioni che possono avvenire sono limitate, perche' tale prodotto genico deve comunque essere funzionante-
LIVELLI DI RESISTENZA
da un flacone contenente 10alla 9 colonie/ml prelevo o,1ml( CIOE'10alla8 colonie) e pongo su terreno di coltura e metto dentro una quantita' di antibiotico superiore alla MIC ( che ha frequenza di mutazione 10-8). Se ho 10 alla 8 batteri con frequenza 10-8 ,potranno crescere 1 o 2 colonie.Prendo 1 o 2 colonie e ne faccio la MIC, le varie mutazioni che portano alla resistenza portano allo stesso risultato , questi sono detti mutanti "single step", cioe' la resistenza e' dovuta ad 1 singolo evento mutazionale.
Esistono antibiotici per i quali non si ottiene nessun mutante resistente anche dopo aver piastrato 0,1ml (10 alla8 batteri) su terreno con antibiotici.Questo e' il caso dei beta-lattamici; ma con dosi superiori alla MIC SI AVEVANO MUTANTI RESISTENTI.
Si ottengono mutanti a dosi leggermente superiori, ma se venivano innestati i batteri subito ad alte dosi di antibiotici con terreno, non comparivano nessuna colonia resistente.QUINDI SI POSSONO OTTENERE MICRORGANISMI VIA VIA RESISTENTI a dosi crescenti , questi si chiamano mutanti multi-step.
per avere 1 resistenza subito ad alte dosi avrei dovuto innestare 10 alla 16 batteri teoricamente possibile ma non in pratica, questo si ha perche' i beta-lattamici hanno piu' siti di azione.
In terapia e' meglio usare antibiotici multi-step perche' avro' bassa probabilita' di insorgenza di resistenza.LA RESISTENZA E' DOVUTA ALLA SIMULTANEA MUTAZIONE DI TUTTI I SITI D'AZIONE DELL'ANTIBIOTICO, QUINDI NELLA RESISTENZA MULTI-STEP, LA RESISTENZA E'DATA DALLA MUTAZIONE DI TUTTI I SUOI SITI.
RESISTENZA ESOGENA
E' data da acquisizione di informazione genica dall'esterno,informazione che il batterio non ha mai avuto.Si tratta di una drastica mutazione.Questo fatto compromette il meccanismo d'azione degli antibiotici, quindi si avra' una nuova funzione che vanifichera' il meccanismo d'azione degli antibiotici.
Questa resistenza non era spiegabile per mutazione cromosomica: se un microrganismo resistente e' immesso in una popolazione resistente ,tutti i batteri diventavano resistenti.
Alcuni microrganismi oltre al cromosoma principale possono avere elementi genetici aggiuntivi, circolari , ,autonomi,perche' il microrganismo puo' acquisire per informazioni dei plasmidi, operazione tuttavia non indispensabile.
Il batterio ha processi tramite i quali scambia informazioni:
1) trasformazione = scambio di DNA ALLO STATO DI MOLECOLA, derivato perv esempio da un batterio che muore e che scoppia e il suo DNA viene spezzettato e i vari frammenti vengono ricevuti e inglobati,
2) trasduzione= processo dovuto a virus batterici, cioe' microrganismi parassiti cellulari obbligati che sono specifici per le varie specie cellulari; il virus mette il proprio materiale genetico, il virus si riproduce per assemblaggio cioe' si sintetizzano i vari cambiamenti che lo compongono; la testa puo' accumulare informazione non solo virale ma anche di DNA BATTERICO,
3) coniugazione = e' il processo piu' importante.Il trasferimento puo' riguardare DNA CROMOSOMICO OPPURE PLASMIDI
e'dato da pili batterici che sono ponti in cui passa materiale genetico .in particolare di plasmidi.E' il processo piu' efficace per il trasferimento e' un processo che avviene non solo tra batteri della stessa specie ma anche tra BATTERI DI SPECIE DIVERSE.
Le vie di trasferimento di informazione genetica avvengono tramite ;
1) PLASMIDI
2) TRASPOSONI
3) RICOMBINAZIONE GENETICA
La coniugazione puo' riguardare o PLASMIDI o frammenti di DNA CROMOSOMICO . I plasmidi sono capaci di replicazione autonoma( = repliconi) quindi" non devono andare da nessuna parte " .
I frammenti di DNA non sono invece dotati di capacita' di replicazione autonoma e si attaccano al cromosoma per ricombinazione genetica cioe' lo scambio di frammenti di DNA deve avvenire solo tra CEPPI OMOLOGHI, MENTRE I PLASMIDI POSSONO TRASFERIRSI anche tra ceppi NON OMOLOGHI in quanto sono dotati di replicazione autonoma.La cellula donatrice non perde informazione genetica ma cede solo una coppia di propri plasmidi. Questi cambiamenti di informazione genetica servono come adattamento a variazioni ambientali come per esempio in presenza di un antibiotico. NOTA BENE la resistenza e' preesistente all'antibiotico.
Si noto' che con il tempo un batterio poteva diventare resistente a piu' antibiotici e se posto in una popolazione sensibile trasmetteva la resistenza agli altri batteri. Esistono plasmidi in cui vi sono geni che codificano delle proteine resistenti ad un antibiotico, pero' esistono geni che codificano per la resistenza a PIU' ANTIBIOTICI e tale resistenza si puo' trasmettere velocemente ad altri batteri.Questo problema puo' essere risolto con l'antibiogramma.
TRASPOSONE: e'sequenza di DNA NON DOTATA DI REPLICAZIONE AUTONOMA , pero' sanno trasferirsi cioe' "saltare" da un replicone all'altro cioe' da una molecola di DNA ad una altra capace di replicazione autonoma ( CIOE' PLASMIDI E CROMOSOMI).Essi possono anche accettare pezzi di DNA. Un trasposone presenta sequenze terminali dette di mobilizzazione , che comprendono geni qualsiasi.Il trasferimento avviene solo se le sequenze terminali hanno una specifica sequenza.Il trasposone puo' essere replicato e trasferirsi ad un altro replicone oppure staccarsi dal replicone e dare il ricucimento delle sequenze alle estremita'.
I TRASPOSONI POSSONO ESSERE PONTI TRA REPLICONI DIVERSI. Questi possono permettere il trasferimento di geni per la resistenza da un replicone all'altro.
Come fa quesTo gene acquisito a portare la resistenza?
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MECCANISMI MOLECOLARI DELLA RESISTENZA ANTIBIOTICA
La resistenza puo' manifestarsi come:
-alterazione del bersaglio su cui agisce l'antibiotico che non riconosce piu' il suo bersaglio esempio la RNA-polmerasi per la rifampicina ( vedi resistenza endogena).
-produzione di enzimi inattivanti cioe' inattivano l'antibiotico. Il batterio deve acquisire un gene ( resistenza esogena) che possa produrre un enzima nuovo da un gene mutato.La resistenza ai beta-lattamici e' sempre di questo tipo:porta a rottura dell'anello beta-lattamico con beta-lattamasi,
-efflusso cellulare attivo:" buttare fuori" cioe' l'acquisizione di un complesso sistema di trasporto di membrana che espelle non un singolo antibiotico ma piu' antibiotici, si tratta di resistenza esogena.
Ogni antibiotico presenta piu' meccanismi di resistenza:
1) ALTERAZIONE DEL BERSAGLIO :cioe' ridotta affinita' dell'antibiotico al bersaglio.Il bersaglio e' mutato in modo che l'antibiotico non si attacca piu'.
E' un tipo di resistenza endogena,infatti consiste in una modifica mutazionale del bersaglio ,cambiamento della sequenza aminoacidica (accade per la rifampicina e i chinoloni) esempio cambiamento della subunita'beta per la RNA-polimerasi per la rifampicina in diversi mutanti resistenti. Cosa cambia nella subunita' beta? La mutazione avviene spontanea tra l'aminoacido 505 e 534 in Escherichia coli, o tra l'aminoacido 399 e 428 per MYCOBACTERIUM tubercolosis ( esempio in Escherichia coli in posizione 512 la serina e' sostituita da Phe o da Pro).Dunque avviene spontaneamente un cambiamento endogeno in aminoacidi.
I beta-lattamici si legano a PBP ma alcune penicilline si legano piu' fortemente a specifiche PBP: esempio la aminocillina si lega a PBP2.E' preferibile usare dei beta-lattamiciche hanno affinita' per piu'PBP.
Un altro esempio e' dato da ribosomi 70S ( esempio neomicina,eritromicina) questi antibiotici si legano a specifici punti delle 2 subunita'.
NOTA BENE : I LEGAMI antibiotico/ bersaglio sono legami non covalenti.Questi casi sono sempre esempi di resistenza ENDOGENA.
2) IPERPRODUZIONE DEL BERSAGLIO: si verifica una sovraproduzione della molecola bersaglio.
La cellula regola la sintesi delle proteine.Esempio: se avviene una mutazione NEL PROMOTORE, per cui la RNA-polimerasi ha maggiore affinita'per esso,si verifica una iperproduzione della proteina codificata da quel gene quindi servono piu' molecole per inibire tutte le molecole bersaglio .E' un esempio di resistenza ENDOGENA.
3)SOSTITUZIONE DEL BERSAGLIO:i chinoloni hanno come bersaglio la DNA-GIRASI.La cellula batterica oltre alla DNA-girasi-bersaglio sintetizza anche una altra DNA-GIRASI pero' deve avere un nuovo gene ,acquisito per resistenza ESOGENA.
Esempio: meccanismo di resistenza agli antibiotici glicopeptidici come la VANCOMICINA da parte degli enterococchi:
i glicopeptidici sono ad alto peso molecolare( vedi definizione generale degli antibiotici).La vancomicina si attacca alla parte terminale della catena aminoacidica del peptidoglicano,bloccandola e impedendo l'azione degli enzimi per la sintesi del peptidoglicano. Nel meccanismo intervienel'acquisizione di 9 nuovi geni da parte di un trasposone per cui ci sono 9 nuove proteine, la cellula cambia la struttura finale del suo peptidoglicano a livello delle ultime 2 D-Ala ( la vancomicina non si lega piu'); una delle proteine sintetizzata dal triposone (detta VAN S) si colloca a livello della parete, si lega alla vancomicina e fa partire un segnale intracellulare che fa sintetizzare le proteine codificate dal nuovo trasposone. Una di queste proteine impedisce la formazione di D-ala (VAN X),VAN H converte il piruvato in D-lattato e VAN A lega una D-ala al D-lattato. Alla fine si sintetizza una catena aminoacidica che non ha piu' due D-ala finali ma una D-ala e un D-lattato cosi' la vancomicina non si lega piu'perche' non si crea un legame H TRA LA CATENA AMINOACIDICA E LA VANCOMICINA.
Infatti si ha la sostituzione di un gruppo -NH con un O- nella catena aminoacidica per la sostituzione di D-ala con D-lattato. Questo e' un esempio di resistenza ESOGENA.Il trasposone presenta una parte alle estremita'che deve essere costante ma la parte costante puo' essere di qualsiasi natura ma da dove viene ? Probabilmente da un lactobacillo che gia' presenta particolarita' nella propria parete e che casualmente ha trasferito il trasposone ad un enterococco.
PRODUZIONE DI ENZIMI INATTIVANTI
consiste nell'acquisizione di geni che codificano enzimi inattivanti per resistenza ESOGENA,
Diversi sono gli antibiotici che hanno tale meccanismo di resistenza:
beta-lattamasi = distruggono l'anello betalattamico delle penicilline e delle cefalosporine inattivandole. Ce ne sono di tanti tipi: i geni per le betalattamasi infatti subiscono una mutazione spontanea che porta alla nascita di una nuova beta-lattamasi.
cat = aciltransferasi:aggiungere un gruppo acetilico al cloramfenicolo, rendendolo inattivo.
Da dove arriva la porzione del trasposone che codifica per l'enzima inattivante? Gli antibiotici sono metaboliti derivati dal metabolismo secondario di alcuni microrganismi.Si e' osservato che in tutti i microrganismi che producono antibiotici, sono presenti i geni che producono enzimi che sanno distruggere tali molecole.Si tratta di geni che la cellula resistente ha gia'acquisito dall'esterno,gia' presente in natura.
EFFLUSSO CELLULARE ATTIVO
si tratta di PERMEASI nella membrana che tramite consumo di ATP, riconoscono l'antibiotico e lo estrudono dalla cellula.
Nei GRAM- c'e' un meccanismo piu' complesso: esempio la tetraciclina e' un inibitore della sintesi proteica, la tetraciclina si lega alla subunita' 50S. Questa selettivita' non e' dovuta a diversita' strutturale tra i ribosomi ma a diversita'di permeabilizzazione in quanto e' elimiměnata tramite pompa di efflusso.
E' una resistenza di tipo ESOGENO.
Esistono molti sistemi che derivano da trasposoni su localizzazione plasmidica, altri da trasposoni su localizzazione cromosomica.
Qualsiasi microrganismo che produca antibiotico ha un insieme di geni che costituiscono una via metabolica per proteggersi dall'antibiotico stesso, tali geni possono essere anche acquisiti da altri microrganismi.
Sappiamo che lo spettro d'azione e' l'insieme dei microrganismi verso cui l'antibiotico e' attivo,ma perche' verso certi microrganismi l'antibiotico e' inattivo? Perche' i microrganismi (esempio la Pseudomonas aeruginosa) hanno acquisito dei sistemi di efflusso. Quindi i sistemi di efflusso derivano da microrganismi produttori di antibiotici e da microrganismi intrensicamente resistenti ( cioe' di una resistenza esogena acquisita tanto tempo fa e che attivano solo con l'antibiotico). Un microrganismo puo' avere uno stesso sistema di efflusso capace di funzionare su antibiotici anche chimicamente diversi,questo e' esempio di resistenza multipla. Esempio la Escherichia coli ha pompe di efflusso per la tetraciclina,cloramfenicolo, beta-lattamici,rifampicina.
Le infezioni NOSOCOMIALI (PRESE IN OSPEDALE) sono le piu' gravi perche' in ospedale si selezionano i microrganismi resistenti.Col passare del tempo gli antibiotici invecchiano perche' col tempo sono note specie resistenti per la formazione di sistemi di efflusso che in alcuni casi si e' tentato di bloccare per esempio con tetraciclina modificata.
Per ogni antibiotico esistono piu' strategie di resistenza , per esempio per i beta-lattamici si ha resistenza in base a permeabilita', affinita', inattivazione (= sopratutto), ridotta attivita'delle funzioni secondarie.
Nella battaglia antibiotico/microrganismo vinceranno sempre i microrganismi. L'antibiotico implica un meccanismo d'azione, implica un bersaglio che puo' cambiare.
NEI DISINFETTANTI NON ESISTE UN MECCANISMO D'AZIONE.
STRATEGIE DI CONTRASTO ALLA RESISTENZA ANTIBIOTICA
consistono nello sviluppare normative razionali per un uso razionale degli antibiotici dal momento che piu' si usano gli antibiotici piu' si selezionano microrganismi resistenti.
ATTENZIONE al rispetto assoluto della posologia
Si sono studiate associazioni di antibiotici noti: esempio chemioterapici che abbassano la biosintesi di acido folico(sulfamidici e trimetoprim) sono associati nel BACTRIM:
se si usano antibiotici con lo stesso meccanismo d'azione, pero' su punti diversi, si riducono ulteriormente le frequenze di resistenza.
E' necessario contrastare l'insorgenza e la diffusione della resistenza e regolamentare l'utilizzazione di antibiotici anche sugli animali. In tutti gli allevamenti zootecnici si e' osservato che se si aggiungevano piccole dosi di antibiotici nel mangime ,si aveva una resa in carne e altro del 10% in piu'.Tali antibiotici erano diversi da quelli per uso umano anche se avevano lo STESSO MECCANISMO D'AZIONE.In questo ambiente si e' usata una quantita' massiccia di antibiotici e cosi' sono nate molte resistenze.
Tutto cio' porta a studiare ,a livelli molecolare ,i meccanismi di resistenza :
- a riprendere la ricerca di nuovi antibiotici e di derivati semisintetici di antibiotici noti ,che risultano attivi sui ceppi resistenti. Bisogna rivalutare antibiotici gia' noti ma non sviluppati, negli anni 60 sono stati brevettati molti antibiotici ma che poi non sono stati messi in commercio.
Tra la scoperta e la messa in commercio possono passare oltre 10 anni. I ceppi di penicillina sapevano produrre
1mg/l di antibiotico quindi bisogna per forza aumentare la produzione di antibiotico.Gli antibiotici hanno un costo proporzionale a quanto se ne riesce a produrre.
-Bisogna ricercare molecole attive sui nuovi bersagli molecolari es : lipide A dei lipopolisaccaridi nei GRAM-.
-Bisogna ricercare molecole attive sui meccanismi di resistenza.
-Bisogna ricercare molecole attive sui meccanismi di patogenesi ( adesine e invasine).